• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        在质粒载体中进行平末端片段的克隆

        互联网

        1376

         

        在质粒载体中进行平末端片段的克隆

         

        1. 分别设立两个反应,用适当的限制性内切核酸酶消化 1~10 μ g 质粒 DNA 和外源 DNA 片段,使它们能产生平末端。

        2. 苯酚:氯仿抽提与乙醇沉淀法纯化出已被消化的载体和外源 DNA 片段。

        3. 分别用 TE pH 8.0 )重新溶解纯化出的两种 DNA 沉淀,使终浓度为 100 ng/ml 假设 1 bp 相当于 660 Da ,计算 DNA 的终浓度( pmol/ml )。

        4. 将载体 DNA 去磷酸化。

        5. 按下表将适量的 DNA 转移至无菌的 0.5 ml 离心管:

           

        管号

        DNA

        A E

        载体 1 [60fmol (~100ng)]

        B

        外源插入片段 2 [60fmol (~10ng)]

        C F

        载体 1 60fmol )和外源插入片段 3 60fmol

        D

        线状载体( 5’- 磷酸化)( 60fmol

        G

        环状载体 [60fmol (~10ng)]

        1 载体 DNA 已进行去磷酸化

        2 外源目的 DNA 可以连接接头。

        3 连接反应中,质粒载体和插入的 DNA 片段摩尔比一般为 1 1 DNA 的总浓度应约为 10ng/ μ l

         

         

        a.       A B C 管中加入:

           10 ×连接缓冲液       1.0 μ l

           T4 噬菌体连接酶       0.5 Weiss 单位

           5 mmol/L ATP        1.0 μ l

           H2 O                  补至 8.5 μ l

           30%PEG 8000          1~1.5 μ l

        b.      D E F 管中加入:

           10 ×连接缓冲液       1.0 μ l

           5 mmol/L ATP         1.0 μ l

           H2 O                  补至 8.5 μ l

           30%PEG 8000          1~1.5 μ l

           不加 DNA

         

         

        6. 连接反应体系置于 16 ℃水浴温育过夜或 20 ℃水浴温育 4 h

        7. 用每份稀释的连接产物转化感受态大肠杆菌。转化时,应包括用标准方法制备的已知量的超螺旋质粒 DNA 作为对照,以检查转化效率。

        管号

        DNA

        连接酶(有 / 无)

        预期转化克隆数

        A

        载体 1

        +

        ~03

        B

        插入片段

        +

        0

        C

        载体 1 和插入片段

        +

        F 管高 5

        D

        载体 1

        -

        ~0

        E

        载体 2

        -

        D 管高 50

        F

        载体和插入片段

        -

        D 管高 50

        G

        环状质粒

        -

        2 × 105

         

         

        1 去磷酸化

        2 未去磷酸化

        3 如果出现来自去磷酸化的载体 DNA 自身连接产物的转化子,是由于用碱性磷酸酶处理时未能除尽 5’ 端的磷酸基。

         

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序