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        甲基化干扰法鉴定与蛋白结合的DNA位点

        互联网

        2514

         

         

        放射性标记 DNA 探针的制备

         

        l      聚丙烯酰胺凝胶的制备

         

        1. 按照(三)中操作流程灌制非变性聚丙烯酰胺凝胶。将 10 × TBE 稀释成 0.5 ×的工作浓度。聚丙烯酰胺的工作浓度取决于待测 DNA 片段的大小, 200bp 左右的片段需要 4 5 %的凝胶,小于 100bp 的片段应灌制 6 8 %的凝胶。

         

         

        l      DNA 的标记

         

        1. 用两种限制性内切酶从 10 μ g 质粒上将待测 DNA 片段切下。注意务必使至少一种酶酶切后产生 5’ 凸出末端。酶切体系终体积 50 μ l ,在适宜的酶反应缓冲液条件下反应 1 小时。

        2. 向酶切反应混合液中加入

        [ α- 32 P]dATP (约 10 μ Ci/ μ l ( 5’ 凸末端含 T 残基 )            10 μ l

        dCTP(2mmol/L)                                               1 μ l

        dGTP(2mmol/L)                                               1 μ l

        dTTP(2mmol/L)                                               1 μ l

        DNA 聚合酶( Klenow 片段)( 5 单位 / μ l                         1 μ l

        室温温育反应体系 30 分钟。

        3. 加入 7 μ l 10 ×上样缓冲液终止反应。

         

         

        l      标记探针的分离

         

        1. 将反应混合物上样于非变性凝胶。

        2. 10 15V/cm 条件下,用 0.5 × TBE 缓冲液电泳 2 3 小时。

        3. 将玻璃板从电泳槽中取出,分开,并使凝胶粘附于其中任一块板上。用保鲜膜将凝胶覆盖起来。

        4. 将凝胶室温下对 X 光片曝光 1 分钟。小心操作使得显像后的 X 光片与凝胶能以曝光时方位复原。

        5. 用保鲜膜覆盖在放射性自显影照片上。再将带凝胶的玻璃板放在其上,以照片为模板,用刀片切下含标记 DNA 片段的凝胶片。将该凝胶片切成小片(约 1mm2 )后,放入微量离心管中。

        6. 向管中加入 1ml 洗脱缓冲液, 37 ℃连续振荡,温育过夜。

        7. 将洗脱液转入两个干净微量离心管中(每管 500 μ l ),然后各加入 1ml 100 %乙醇,- 80 ℃放置 10 分钟。室温离心 15 分钟沉淀 DNA

        8. 弃上清,用 80 %乙醇洗沉淀,室温离心 5 分钟,用长颈巴斯德吸管移去上清,再用真空离心蒸发浓缩器或干燥器干燥沉淀。

        9. 用闪烁计数器测定样品中的契仑科夫辐射量。将沉淀溶于适量 TE 中使标记探针的浓度为约 104 cpm/ μ l

        甲基化反应

         

        1. 室温下,于微量离心管中建立如下列反应(每一 DNA 片段需 6 个离心管, 3 个用于起始反应, 3 个用于终止反应)

           

         

         

        1

        C 反应

        2

        为结合的 G 反应

        3

        A G 反应

        起始反应液

         

         

         

         

         

         

        DMS 缓冲液

        200 μ l

        200 μ l

        H2 O

        18 μ l

        载体 DNA

        1 μ l

        1 μ l

        1 μ l

        DNA 探针

        1 μ l

        10 μ l

        2 μ l

         

         

         

         

        4

        C 终止

        5

        G 终止

        6

        A G 终止

        终止反应液

         

         

         

         

         

         

        DMS 终止液

        50 μ l

        50 μ l

        醋酸钠( 0.3mol/L; pH7.0

        200 μ l

        乙醇( 100 %,冰预冷)

        1mol

        1mol

        1mol

         

         

        2. 1 号和 2 号管中加 1 μ l DMS ,并加 3 μ l 10 %甲酸于 3 号管中起始反应。

        3. 1 号和 2 号管在 16 ℃下放足 4 分钟, 3 号管在 37 ℃温育 15 分钟。加入适量终止液终止反应。

        4. 剧烈振荡离心管并置于干冰 / 乙醇浴 6 分钟。

        5. 4 ℃离心 7 分钟。

        6. 用长巴斯德吸管弃上清,用 1ml 100 %乙醇清洗沉淀。

        7. 室温下离心 3 分钟。

        8. 弃去上清。

        9. 用干燥器或真空离心蒸发浓缩器干燥沉淀, 2 号管的 DNA 沉淀用于结合反应, 1 号及 3 号管保存于- 20 ℃备用。

        蛋白 /DNA 结合反应

         

        l      聚丙烯酰胺凝胶的制备

         

        灌制 5 %非变性聚丙稀酰胺凝胶,用 10 × TGE 配制 TGE 终浓度为 1 ×的凝胶。

         

         

        l      结合反应

         

        1. 23 μ l H2 O 溶解已干燥、甲基化的、标记的 DNA 沉淀( 2 号管)。

        2. 加入:

        poly(dI-dC) poly(dI-dC)(1 μ g/ μ l)                                2 μ l

        蛋白提取液                                              10 20 μ l

        结合缓冲液( 10 ×)                                           5 μ l

        加水至终体积为 50 μ l

        3. 室温下,进行 30 分钟的结合反应。

        4. 3 μ l 上样缓冲液到样品中并上样 5 %非变性聚丙酰胺凝胶。

        5. 1 × TGE 10V/cm 下电泳 2 3 小时,分离游离的和与蛋白结合的 DNA 片段。

        6. 从电泳槽中移出玻璃板并将两玻璃板分开使胶附着于一玻璃板上,用 Saran® 膜覆盖在胶上。

        7. 室温下凝胶对 X 光片曝光 1 2 小时,小心放射自显影胶片显像后,使胶片正确地与凝胶原位重合。

        放射性标记 DNA 带的洗脱

         

        1. Saran® 保鲜膜包裹放射自显影胶片并放在一次性白色托盘上。展开凝胶并将支撑凝胶的玻璃板放在显像过的胶片上,使得玻璃板的角和胶片的角对齐,显像后的胶片为模板,用刀将含有放射性标记 DNA 片段(包括游离和与蛋白结合的片段)的聚丙烯酰胺凝胶的带块切下。

        2. 1.5g 琼脂糖溶于 100ml 1 × TBE 中,微波炉加热熔化后冷却至 60 ℃时灌制凝胶,配成 1.5 %琼脂糖胶一块 6.5cm × 10cm × 0.5cm 大小的微型凝胶就足以满足该实验。

        3. 用解剖刀在琼脂糖胶上切出 0.5cm × 1cm 的小孔并用 1 × TBE 灌满。

        4. 用一张 0.5cm × 0.5cm NA45 膜放在每个小孔中并保证这膜延伸到阳极。

        5. 用镊子将聚丙烯酰胺凝胶的小胶块放在每个孔中,可稍折小条块,使其放入孔中。用电压梯度使 DNA 能迁移到 DNA45 膜上,在 1 × TBE 缓冲液中进行电泳,在洗脱过程中, DNA 的迁移完后即可关闭电源,将小胶块用镊子移去,用盖革计数器来检测。

        6. 用镊子将膜转移至微量离心管中,每个管中加 100 200 μ l 洗脱缓冲液,确保每片膜能完全浸泡在缓冲液内。

        7. 68 ℃温育 30 60 分钟。

        8. 将洗脱液转移入新管中,加等体积苯酚 / 氯仿( 1 1 ),剧烈振荡。

        9. 室温下离心 5 分钟相,将上层液相转至新管中。

        10.  每管加入 5 μ g 经超声波处理的鲑精 DNA ,再加入 2 倍体积 100 %乙醇,在- 80 ℃下放置 10 分钟以沉淀 DNA

        11.  4 ℃离心收集 15 分钟沉淀 DNA

        12.  用巴斯德吸管吸去上清,用盖革计数器检测标记 DNA

        13.  80 %乙醇 500 μ l 清洗沉淀小块,振荡、 4 ℃下离心 5 分钟。

        14.  弃去上清,用干燥器或真空离心蒸发浓缩器干燥沉淀。

        DNA 片段的切割和变性 PAGE 分析

         

        l      变性聚丙烯酰胺凝胶(测序用)的制备

         

        1. 清洗并硅化两块玻璃板( 33cm × 42cm 33cm × 39cm ),然后用 100 %乙醇轻擦表面后,将两块玻璃板的池用 0.2mm 厚的垫条隔开,组装好玻璃板。

        2. 10 APS 200 μ l TEMED 200 μ l 100ml 变性胶贮液中,混合后立即灌入已准备好的玻璃间,插入梳子,让胶聚合 1 2 小时。

        3. 拔去梳子将玻璃板装在电泳槽中,用 1 × TBE 加在上下槽内,用巴斯德吸管以 1 × TBE 冲洗加样孔,在 40 50W 下预电泳 1 小时。上样前使胶预热是非常重要的。

         

         

        l      切割反应

         

        1. 在每一干燥的 DNA 沉淀中(即样品 1 4 )加入 10 %哌叮 100 μ l

        2. 90 ℃温育 30 分钟。

        3. 用针在每个离心管盖子上刺一个小孔,将冷冻干燥已切割的 DNA 样品在真空离心蒸发浓缩器中 2 5 小时或直至完全干燥。

        4. 用闪烁计数确定每一 DNA 样品的契仑科夫辐射量。

        5. 将测序染液加到 DNA 样品中,使 1 3 号样品的终浓度为 5000cpm/ μ l ,而 4 号应为 104 cpm/ μ l

        6. 100 ℃处理 10 分钟使 DNA 变性,然后置于冰上冷却。

        7. 40 50W 预热 1 小时的变性聚丙烯酰胺凝胶的加样孔内上样,每个样品上 5 μ l

        8. 根据 DNA 片段的长度, 40 50W 下电泳 2 3 小时。

        9. 从电泳槽上取出玻璃板,去掉垫条使凝胶附在其中一块玻板上,小心地将一块 Whatman 3MM 纸板放在胶上,慢慢剥下纸板使胶附于其上,用 Saran 膜覆盖凝胶, 80 ℃干燥 1 小时。对干燥的凝胶用 X 光片在- 80 ℃下曝光过夜,以显示 DNA 条带。

         

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