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        RNA-蛋白质的相互作用1

        互联网

        2467

         

         

        叶绿体RNA的体外加工与紫外交联分析RNA

        RNA的合成

         

         

        l      DNA 模板的线性化

         

        1. 根据供应商的指导用合适的限制酶酶解含有 DNA 模板(如亚克隆在转录载体如 pBluescript® Stratagene )上的菠菜叶绿体 psbA 基因)的质粒( Schuster and Gruissem1991 )。

        2. DNA 琼脂凝胶( Sambrook et al. 1989 )分析线性化质粒以检查酶解是否完全。

        3. 用乙醇沉淀 DNA Sambrook et al. 1989 ),并重悬 DNA 沉淀于水中,调整线性 DNA 终浓度为 200 μ g/ml

         

         

        l      DNA 模板的转录

         

        1. 向微量离心管加入下列反应液

        DNA 模板                                     2 μ l 0.4 μ g

        反应缓冲液( 5 ×)                                     4 μ l

        DTT 40mmol/L                                    0.5 μ l

        NTP 混合液(用于 H RNA X RNA                  2 μ l

        RNA 酶抑制剂                          0.5 μ l (约 15 单位)

        H2 O              H RNA 8.5 μ l 或对 X RNA 2.5 μ l

        为避免 DNA 的亚精胺沉淀,须在室温或 37 ℃加各种试剂。

         

         

        注: H RNA 用于体外加工测试; X RNA 用于 UV 交联测试

         

        NTP 混合液( H RNA 用): 5 mmol/L GTP CTP ATP   0.25mmol/L UTP

         

        NTP 混合液( X RNA 用): 5 mmol/L GTP CTP ATP

        2. 向反应液中加入 2 μ l (对 H-RNA )或 8 μ l (对 X-RNA )α -[32 P]UTP

        3. 0.5 1 μ l (即 10 20 单位) SP6 T3 T7 聚合酶使反应终体积为 20 20.5 μ l

        4. 37 ℃温育 40 60 分钟。

        5. 加入 15 μ l 5mol/L 乙酸胺和 100 μ l 100 %乙醇沉淀 RNA

        6. 20 ℃放置 10 分钟, 4 ℃离心 10 分钟。

        7. 弃上清,空气和真空干燥 RNA 沉淀,用 7 μ l 甲酰胺染液重悬 RNA

        8. 在沸水中将 RNA 重悬液煮 3 分钟后,于冰上快速冷却,加样于 6 %的变性丙稀酰胺凝胶。

        9. Saran® 膜包上凝胶,对 X 光片曝光约 20 秒。

        10.  切下含有 RNA 的凝胶片放入 1.5ml 微量离心管中。

        11.  在该离心管中加入:

        DEPC 处理过的水                               180 μ l

        DEPC 处理过的乙酸钠( 3mol/L, pH5.5           20 μ l

        DEPC 处理过的 EDTA 0.25mol/L                   1 μ l

        SDS 20 %)                                     1 μ l

        12.  65 ℃温育 1 1.5 小时或 40 ℃下过夜使 RNA 从凝胶中扩散出来。

        13.  RNA 液转移入新的微量离心管中,加入 500 μ l 100 %乙醇,- 20 ℃放置 10 分钟。计数契仑科夫辐射。

        14.  离心 10 分钟沉淀 RNA ,弃去上清,真空下干燥沉淀,在进入下一操作前用合适的缓冲液重悬 RNA

         

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