DNA基础知识

腺病毒（adenovirus，Ad）最初由W. P. ROWE等人在人腺样体中分离得到并命名，这是一种直径为70-100nm、无包膜的双链DNA病毒。目前已知的人腺病毒血清型有50多种。其中基于人腺病毒5型（Ad5）改造的载体使用较为广泛，其特点是人为地删除了E1和E3基因，导致腺病毒失去复制能力和一定程度上降低免疫原性，使得Ad5成为一种广泛、安全、有效的基因运输载体。根据重组腺病毒的特点，我们继续了解腺病毒在不同领域中 ...

核型分析简介染色体是细胞分裂期高度凝集的 DNA 蛋白质纤维，是间期染色质结构紧密盘绕折叠的结果。核型是指一个体细胞内的全部染色体按其大小、形态特征排列起来构成的图像。将待检细胞进行染色体数目、形态结构分析，确定其核型是否与正常核型一致，称为核型分析。染色体核型分析，是遗传学科学研究和辅助临床诊断的重要手段之一，是分析染色体易位、缺失，诊断各种遗传病变的关键指标。染色体核型分析实验是选择增殖旺盛期的细胞进行秋水仙素处理 ...

做了 5 年的 MTT 实验 ，耗费了上万块 96 孔板。有成功的喜悦，有失败的沮丧，有好多话要对各位实验同仁说。在这之前，我们先回顾一下 MTT 的原理及操作步骤。实验原理MTT 是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素 C 的作用下，生成蓝色的 formazan 结晶。formazan 结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将 MTT 还原，无法形成结晶），且该结晶溶解于 DMSO。利用酶标仪测定波长 490 nm 处的光密度 OD ...

CRISPR：细菌体内一串规律成簇的间隔短回文重复 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)DNA 序列，是大多数细菌及古细菌中一种获得性免疫系统。现在使用的 CRISPR/Cas 9 系统是由最简单的 type II CRISPR 改造而来，该系统由单链的 guide RNA 和有核酸内切酶活性的 Cas 9 蛋白构成。原理此系统的工作原理是 crRNA(CRISPR-derived RNA) 通过碱基配对与 tracrR ...

基因编辑技术的飞速发展, 特别是近年来 CRISPR 技术的广泛应用，使得人类拥有了前所未有的改变和修饰基因组的能力。CRISPR 技术来源于细菌本身对抗噬菌体的「免疫系统」，这项技术利用单链引导 RNA(sgRNA) 和 Cas9 蛋白，可以在体内和体外简单、迅速、低成本实现基因编辑。利用 CRISPR 技术不仅可以对编码基因进行有效编辑和基因组的大规模筛选，而且还可以结合 NGS 对非编码 RNA（ncRNA）进行功能研究。CRISPR 技术已经广泛应用于全球各个 ...

woshizhixiaofei 如题，谢谢大家song333 cut the part containing the plasmid, put in water (small volume if possible), then transformation using the water (containing plasmid).fengye_liu cut the part containing the plasmid, put in water (small volume if possible), then transformation using ...

lope 请教各位大侠：购买的UPSTATE的TOPFLASH/FOPFLASH质粒，准备做双荧光素酶报告基因检测，看文献上都只是用这个质粒和Renilla的载体共转染细胞，是否这个质粒本身就携带了Firefly萤光素酶呢？我看了说明书，只是说two full and one incomplete copy of the TCF binding site (mutated) followed by three copies in the reverse orientation, upst ...

穿越之后叫小丫 新构建的质粒抽提后跑PCR能跑出我的目的条带，但是酶切验证时却没有我要的片段，我把扩增目的片段的引物和原始质粒做了比对并没有互补序列啊，这是什么情况呢？电泳图在附件中，请各位大侠帮忙解解惑啊！谢谢！济南基美 可能是引物中污染了模板或者是酶切不成功ylong12 看下你构建载体时的酶切时间 时间太长 易产生星活性 这样的话 你PCR结果没错 但是你就切不开了穿越之后叫小丫 济南基美 wrote:可能是引物中污染了模板或者是酶切不成 ...

liuruya 问别人要了个带GFP-tag（GFP-N2载体）的质粒，目的基因1.4kb，分子量约52kD，转染293T细胞能见荧光，WB杂不出来，设置了阴性和阳性对照证实不是WB的技术问题。后来又换了个flag-tag，仍然杂不出来WB。仔细检查过序列，不存在移码的问题，非常费解。有同学分析是空间位阻问题，不知换个tag是不是能解决这个问题。有同学遇到过这种问题么，或者帮忙分析一下可能的原因。谢谢！！！zhuqueleee ...

dengjie19841217 大家能不能帮我看看这张质粒双酶切的电泳图，上方边缘怎么会这么毛糙，本来是要切胶纯化后作插入目的片段的，怕会影响后面的连接，所以没纯化！已经出现两次同样的状况了，之前做的时候都还是很干净的一条带，不知道是怎么回事啊！载体是pGL3-Basic，酶切位点Mlu I和Xho I，酶切2小时后，1%琼脂糖凝胶电泳，80v电压45min。大家快来帮帮我吧falan87 我最近也在做双酶切连接，做了好几次都出 ...

soarmlxq 有个同学问我，DNA为什么是双螺旋的？它靠什么来形成双螺旋？我告诉他书上说是碱基堆积力。可是这么回答总觉得不够具体。碱基堆积力究竟是怎样的一种力呢？简单的碱基堆积力就能形成双螺旋结构吗？而且脱氧核苷酸本身也不是平面的，它立体的分子构造是不是也对它形成双螺旋结构有帮助呢？另外，如果存在满足以上条件的其他分子双链是否也会形成双螺旋结构？请各位高人帮忙给我一个更确切的答案！谢谢！nono1986 为什么是 ...

zhangyuxianggx 各位大侠好！现有pcDNA3-mCherry和pGEM-hgene两个东西在滤纸上，老师就说让构建载体，具体是什么意思啊？我理解的是一个真核表达载体和构建好的pGEM质粒，但是不知下一步该怎么做？恳请各位好心的大侠指点一二。shylook 直接插入cDNA吧zhangyuxianggx 那个pGEM就是已经插入了DNA的载体。请问这两个东西溶下来以后要怎么保存zjubell 剪下来。TE融解，再 ...

wangch84 各位高手，兄弟最近忙于质粒构建，意图将一段长约4000 bp的片段，通过BamH1和EcoR1两个酶切位点连接到pcDNA3.1+载体上。情况如下：1. 通过LA Taq酶扩增，并纯化回收目的片段（引物中带有酶切位点，保护性碱基＝3，上游带有Kozak序列）；由于回收效率很高，所以在进行下一步双酶切时只加了12 μl的目的片段，H2O 20 μl，10 X K BUFFER 4 μl，两种酶各2 μl，37℃作用过夜（12-14 h），再进行胶回收。2. 载体pc ...

指葫芦 我是一个初学者，要大量提质粒。发现实验室的离心机最高为4300rpm，可是说明书上要求13000rpm。想请问各位达不到说明书上的要求可以吗？再者，提质粒的时候不是都要低温吗？为什么说明书上说的是常温离心？望请大家帮忙帮忙，再此不甚感激！shylook 你用天根这样的kit做大抽的话因为不是考离心沉降质粒所以 我想 速度影响不大 你试试其他kit 4300rpm的话 你延长一倍时间也应该可以wwjsix 最好按照说明书来说。质粒抽 ...

lixingliang1987 本人最近小提质粒，挑取单克隆于3毫升LB培养基培养6小时候抽质粒，发现浓度只有50纳克每微升。后来重新挑取单克隆于10毫升LB培养基培养14小时，收集10ml菌液进行离心，裂解，上柱（10ml菌液只上一个柱子，量绝对足够了吧），结果浓度才300纳克每微升，我本计划下步做转染，如此低得浓度我很是担心啊不知道大家有没有遇到过此情况。我用的是pEGFP-N2质粒，是高拷贝的。PS：我怀疑是不 ...

doctorchihlee 大家好，请问一下空白载体（含GFP,但不含靶基因）成功转染哺乳动物细胞后，荧光显微镜下观察GFP，观察到细胞全部呈绿色还是仅仅外周发光或是核发光？谢谢！doctorchihlee GFP在细胞质，是全部发光？！？real_madrid_146 这个是我用pEGFP-C2转HEK293的图。shylook 就是这样的济南基美 全部发光，GFP由于比较小，会有部分可以进入细胞核，有文献报道过本文由丁香园论坛提供， ...

happy0coral 哪位大侠能告诉我用pre-miR转染是属于瞬时还是稳定转染啊，另外是不是只要是转染就叫miRi啊sxj_fish 很多基因都是可以转染的　，ＤＮＡ也可以转染，还有ＳＩＲＮＡ也是可以转染的芍药香 可以选用瞬时转染也可以选用稳定转染，不过现在microRNA的前体转染大多是瞬时的。转染只是实验方法，应用于多种核酸的转入。artneer pre-miRNA是属于瞬转，因为转染miRNA的成熟序列很多情况下效果 ...

zjf0709 左侧的是提取的PUC18质粒，中间的marker不太好（可以忽略），右侧的marker是DL2000，由于跑得时间过长所以marker跑散了，右侧DL2000最上面的一个条带是2000bp，PUC18的序列是2686bp，为什么会跑的比2000bp还快？这个现象正常吗？是不是超螺旋的问题？请大家帮忙解答，谢谢！！！zjf0709 自己顶一下，请大家帮忙看一看。济南基美 是超螺旋的质粒，所以跑的快。一条带，说明都是 ...

linjl010 各位专家，我构建了一个表达载体，大小接近9K，目的是想验证猪的该基因表达情况，所以可以转染哪几种细胞，希望用一种转染效率高的细胞。谢谢大家！shylook hela咯章信来 293也成的本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴师兄微信号：shixiongcoming

whm5869 我构建了一个质粒，包括目的基因片段和一小段启动子，测序结果完全正确，我们实验室的工作人员说理论上应该表达但是我转染细胞做WESTERN鉴定，就是不表达，请问这是为什么啊，谢谢各位大侠了whm5869 我用的是polyjet转染试剂，操作等基本没问题，谢谢大家了pharmaceutic 以前我站构建质粒的时候也遇到过这种问题，最后换了一个载体以后就表达了。最后分析认为不同的基因可能有启动子喜好，一般情况下 ...