免疫细胞与组织染色实验

荧光的淬灭及抗淬灭 1)荧光的淬灭：荧光淬灭(quench)是指荧光分子由内部因素和外部因素同时作用造成的不可逆破坏。内部因素主要是分子从激发态回到基态以非辐射跃迁形式释放能量。外部因素则包含多方面，主要有： ①光照射是致荧光淬灭的最常见原因，荧光的产生需要光照射，但同时光照射也会促进激发态分子与其他分子相互作用而引起碰撞，使荧光淬灭； ②荧光物质的分子与外部分子(或离子)形 ...

免疫荧光组织化学直接法 (1)检查抗原法：此法是免疫组织化学最早使用的方法，用荧光素标记已知特异性抗体，直接与组织细胞中相应抗原结合，在荧光显微镜下可见抗原存在部位呈现特异性荧光。此法特异性强，快速而简便，但是，由于一种荧光抗体只能检测一种抗原，很难获得各种市售的特异性荧光标记抗体；此外，该方法敏感性较低。(2)检查抗体法：将抗原标记荧光素，即为荧光抗原。将此荧光抗原直接与细胞或组织内相应 ...

免疫荧光组织化学间接法 (1)检查抗原法：第一抗体不标记，使用与一抗种属相同抗体的Fc段(有种属特异性)作为抗原免疫动物，制备抗抗体。即第二抗体。并用荧光素标记第二抗体。反应时，首先用特异性抗体(第一抗体)与组织细胞中的相应抗原反应，然后用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再用荧光素标记的第二抗体与结合在抗原上的第一抗体结合，形成抗原―抗体―荧光抗体复合物。由于结合在抗原―抗体复合物上的荧光抗 ...

间接法免疫荧光组织化学染色步骤 1．检测抗原法以单层细胞培养标本为例介绍此法的染色步骤： (1)取出细胞贴附生长的小盖片，用预热的PBS冲洗2次； (2)4％多聚甲醛(或冷丙酮)固定5～10分钟，晾干； (3)0．01MPBS(pH 7．4)漂洗3次，每次5分钟。 (4)0．3％Triton X-100孵育，室温20分钟，PBS漂洗2次(细胞膜抗原可省略此步骤)； ...

SABC―Cy3法免疫荧光组织化学染色步骤 在免疫荧光组织化学技术中，常用方法还有SABC-Cy3法。它的基本原理和染色步骤与免疫组织化学中SABC法大体相同，唯一不同的是亲和素―生物素―辣根过氧化物酶复合物中的酶组分被荧光素Cy3替代，从而形成亲和素―生物素-Cy3复合物，故称之为SABC―Cy3法。在其染色步骤中没有酶与底物和供氢体的显色作用，取而代之的是荧光素染色。由于Cy3所产生的 ...

免疫荧光组织化学对照实验 为保证免疫荧光组织化学染色的特异性，排除非特异性染色，必须在初次实验时进行对照实验。 (1)直接法需设的对照实验 1)标本自发荧光对照：标本只加PBS或不加PBS，甘油缓冲液封片，荧光显微镜观察应呈阴性荧光，即未见与特异性荧光相似的荧光。 2)抑制实验：可分为二步法和一步法。二步抑制法即在标本上先加未标记的特异性抗体，再滴加标记荧光抗体，结 ...

补体法免疫荧光组织化学染色步骤 1．材料 (1)免疫血清60℃灭活20分钟，用Kolmers盐水作2倍稀释成1：2、1：4、1：8或更高。如免疫血清补体结合的效价为1：32，则免疫血清应作1：8稀释。Kolmers盐水配制：在pH 7．4，0．1mol／L的磷酸缓冲盐水中溶解MgSO4，含量为0．01％； (2)补体用新鲜豚鼠血清，一般作l：10稀释或按补体结合反应试管法所测定 ...

荧光显微镜的组成 生物荧光显微镜主要由照明系统、滤光片系统和显微镜三部分构成： (1)照明系统：生物荧光显微镜包括高压和低压两个照明系统，高压汞灯可发射出各种波长(紫外到红外)的光，提供激发光光源，用于荧光显微镜观察。低压光源的卤素灯提供可见光，用于普通显微镜观察。 (2)滤光片系统 1)激发光滤片(excitationfilter)：位于光源和显微镜之间的光路内，其 ...

荧光显徽镜的分类 1903年Wood首次设计了一种能吸收可见光和允许紫外光通过的滤片。以此为基础，1911年Reichert设计了第一台荧光显微镜。随着荧光染色方法和荧光显微镜装置的改进，尤其是荧光抗体技术的建立，荧光显微镜在生物医学各领域的应用愈来愈广泛。荧光显微镜是利用一定波长的光(通常是紫外光或蓝紫光)激发显微镜下标本内的荧光物质，使之发出荧光，呈现荧光影像。荧光显微镜包括光源、滤片 ...

双重染色法免疫荧光组织化学染色步骤 若在同一标本中有A和B两种抗原需要同时显示，A抗原的抗体用FITC标记，B抗原的抗体用TRITC标记，可采用以下染色方法：免疫荧光细胞化学双重染鱼法原代培养胚胎14天大鼠端脑细胞：在骨发生形态蛋白―{诱导下，乙酰胆碱转移酶(呈绿色荧光)和同源域蛋白Islet―1(呈红色荧光)共存于细胞质内(激光扫描共聚焦显微镜观察) 1．一步双染色法先将两种荧 ...

荧光显微镜的基本操作及注意事项 1．基本操作步骤 (1)安装紫外防护罩。 (2)打开高压汞灯的电源控制箱开关。 (3)插入挡光板，中断光路。 (4)预热5―10分钟。 (5)将载有样品的载玻片放到载物台上。 (6)选择接物镜(按照先低倍，后高倍顺序)。 (7)旋转分光镜组件转盘，选择所需要的分光镜组件：“O”为观察透射光时用；“WU”为观察蓝色荧光 ...

激光扫描共聚焦显微镜样品制备特点 (1)样品制备基本要求：激光扫描共聚焦显微镜与荧光显微镜样品制备基本相同，不同的是组织可切为厚切片，实现三维重建图像。由于激光扫描共聚焦显微镜通常为倒置式，载玻片上附着的盖玻片面积要大，上机观察时盖玻片应朝下放置在载物台上。 (2)常见器皿：激光扫描共聚焦显微镜的载物台设计灵活，可以放置载玻片、35mm和50mm平皿、培养皿、活细胞观察及灌流系统等 ...

非特异性荧光染色的消除 组织的非特异性荧光染色机制很复杂，其产生的原因主要有：一部分荧光素末与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，不能被除去；抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白与组织成分结合；除被检抗原以外，组织中还存在类属抗原(如Forssman抗原)，可与组织中特异性抗原以外的相应抗体结合；从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致 ...

核酸的化学组成与基本结构 核酸是一类十分重要的生物大分子。生物界的核酸可分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两类。两类核酸均由含氮碱、戊糖及磷酸三种成分组成。其中DNA所含的戊糖为脱氧核糖，而RNA所含的为核糖。核酸中的含氨碱简称碱基，包括嘌呤碱和嘧淀碱两类。嘌呤碱有腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，嘧啶碱有胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T)。DNA和RNA含有的共同碱基是A、 ...

免疫荧光组织化学双重染色在神经元发生研究中的应用 由于大脑中胆碱能神经元直接参与人类运动、学习和记忆．它的胚胎发生和发生机制一直是神经科学的热点，因为这一问题的解决可能会找到治疗胆碱能系统退行性疾病的有效途径，也将阐明神经元如何发生这个神经科学的基本问题。要实现这一目标，首先要确定胚胎发生过程中胆碱能神经元的时空定位、胚胎来源以及如何获得胆碱能表型的过程。关于胆碱能神经元在端脑的时空定位． ...

组织芯片申免疫荧光染色的定量分析 组织芯片(tissue chip)技术是一种快速、经济及高通量的现代组织化学技术。组织芯片又称组织微阵列(tissue mlcroarray，TMA)，它是将数十个乃至数以千计不同来源的组织样品粘贴到同一张固相载体如玻璃片或硅片上，形成组织微阵列。在同一反应条件下进行免疫组织化学染色，以了解病变组织与相应正常组织内蛋白质等抗原的细胞来源、分布特征和表达差异 ...

基因组DNA探针与cDNA探针 所谓探针，是一种已知的特异性分子，一种仅与特异的靶分子反应的分子。它可结合适宜的标记物．以便在与靶分子反应后被检测。核酸探针是指带有标记物的已知碱基序列的核酸片段，它仅与靶核酸即待测核酸反应。在原位杂交中，核酸探针是用于组织细胞内特定核酸序列定位的关键试剂。 根据核酸性质的不同．核酸探针可分为基因组DNA探针、cDNA探针、cRNA探针、寡核苷酸探针 ...

cRNA探针 cRNA探针是以eDNA为模板在体外转录而成的探针，可方便地通过已克隆于特定质粒载体的，DNA产生。这些质粒通常在紧邻多克隆位点的位置含有一个噬菌体启动子。应用相关的RNA聚合酶和4种核糖核苷(rNTPs)(其中至少一种带有标记物)进行体外转录反应，依赖DNA的RNA聚合酶以克隆的cDNA为模板，以含有标记物的三磷酸核糖核苷为原料，从启动子下游开始在体外转录产生RNA。通过改 ...

DNA变性与复性 一、变性 DNA的三维空间构象即超螺旋结构主要靠一些非共价键如氢键折叠形成，这些非共价键都是键能较低的键，很容易在外来作用的影响下断裂，使双螺旋解开，导致空间结构破坏，使规则的DNA变成不规则的线团，因而发生性质改变，称为DNA变性(denaturation)。变性的DNA为单链。加热接近100℃、改变pH(10或 如果通过加热使DNA变性，根据DNA变性的程 ...

寡核苷酸探针 寡核苷酸探针是指用化学合成技术在体外合成的单链DNA，长度一般为30―50bp。寡核苷酸探针目前均由DNA合成仪合成。 在确定寡核苷酸探针的序列时，一定要使该探针能与靶核酸序列特异性结合，而与无关体外转录法制备tRNA探针原理图序列不会产生杂交反应。如果靶DNA或mRNA的序列是已知的，合成寡核苷酸的序列按照碱基互补原则很容易确定。如果仅仅知道氨基酸序列，探针的设计则 ...