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        cRNA探针

        互联网

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        cRNA 探针
         
            cRNA探针是以eDNA为模板在体外转录而成的探针,可方便地通过已克隆于特定质粒载体的,DNA产生。这些质粒通常在紧邻多克隆位点的位置含有一个噬菌体启动子。应用相关的RNA聚合酶和4种核糖核苷(rNTPs)(其中至少一种带有标记物)进行体外转录反应,依赖DNA的RNA聚合酶以克隆的cDNA为模板,以含有标记物的三磷酸核糖核苷为原料,从启动子下游开始在体外转录产生RNA。通过改变外源cDNA在质粒中的插入方向或选用不同的RNA聚合酶,可以控制RNA的转录方向(即以cDNA的哪条链为模板转录RNA),从而可以得到与mRNA同序列的同义RNA探针(senseprobe)或与mRNA互补的反义RNA探针(antlsense probe),后者即互补RNA(cRNA)探针。通常用同义RNA探针作cRNA探针的阴性对照。
         
            由于在体外转录反应物中可提供有标记物标记的核苷酸为原料.因此经过体外转录就能得到标记的cRNA探针。ceRNA探针是单链探针,故以cRNA探针进行杂交反应可避免应用双链cDNA探针作杂交反应时存在的两条链之间的复性问题。cRNA和mRNA之间形成的杂交体要比cDNA-mRNA杂交体稳定.因此杂交反应后可经受高严格度洗涤。cRNA -mRNA杂交体不受RNA酶的影响,故杂交后还可用RNA酶处理,以除去未结合的探针。此外,体外转录合成的cRNA探针的长度比较一致。
        cRNA探针
        体外转录法制备cRNA探针原理图
         
            由于cRNA探针具有以上优点,因此在分子杂交中,特别是在原位杂交中的应用较广泛。但cRNA探针的制备过程较复杂,需要较高的分子生物学实验条件,cRNA对RNA酶敏感,易被RNA酶破坏,因而在操作过程中需严格防止RNA酶污染。
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