免疫荧光组织化学双重染色在神经元发生研究中的应用

互联网2010-12-02

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免疫荧光组织化学双重染色在神经元发生研究中的应用

由于大脑中胆碱能神经元直接参与人类运动、学习和记忆．它的胚胎发生和发生机制一直是神经科学的热点，因为这一问题的解决可能会找到治疗胆碱能系统退行性疾病的有效途径，也将阐明神经元如何发生这个神经科学的基本问题。

要实现这一目标，首先要确定胚胎发生过程中胆碱能神经元的时空定位、胚胎来源以及如何获得胆碱能表型的过程。关于胆碱能神经元在端脑的时空定位．20世纪80年代末美国几个实验室报道了几乎一致的研究成果。而对于后两个问题始终一筹莫展。

有一天，在翻阅文献时我发现了一个奇怪现象，U.E．Schambra(1989年)和他的同事在使用乙酰胆碱转移酶(choline acetyltransferase，ChAT)作为胆碱能神经元标志性蛋白追踪胆碱能神经元的时空定位时发现，在端脑背侧脑室区有许多正在进行有丝分裂的细胞表达ChAT。

他们对此感到非常惊奇，又无法解释这种现象，故在论文中仍然把这些细胞看作胆碱能神经元(U．B．Schambra，1989年)。

传统观点认为：已分化的功能神经元不可能进行有丝分裂。在端脑发育为大脑的过程中，其脑室区的神经上皮细胞分裂之后。分化为成神经细胞便开始迁移，直至目的地才获得神经元表型。

正当这些疑团在脑海中百思不得其解的时候，联想到前不久在Nature杂志中看到一篇令人震撼的研究论文：美国Columbia大学S．CNoctor和他的研究小组为观察端脑脑室区具有分裂能力的神经上皮细胞产生成神经细胞的过程?

将表达绿色荧光蛋白(GFP)的逆转录病毒注射到胚胎15、16天大鼠侧脑室，24小时后．具有放射状胶质细胞形态的细胞均表达高水平GFP，并显示波形蛋白 (Vimeritin)阳性，波形蛋白是放射状胶质细胞的标志性蛋白。

3天后沿皮层板(大脑皮质发育的原基)方向出现放射状排列的克隆，每个克隆包含2～17个细胞不等，其中含有几个Ⅲβ神经微管蛋白(TUJl)阳性细胞和通常为一个放射状胶质细胞。

使用显微延时摄影(time-lapse images)记录随时间变化的克隆．发现已，有GFP的放射状胶质细胞发生不对称分裂，并产生成神经细胞，后者沿着产生它的放射状胶质细胞突起向皮层放射状迁移，并分化为皮质锥体神经元(Stephen C. Noctor，2001年)。

因此，他们得出放射状胶质细胞不但具有胶质细胞性质而且还有神经干细胞性质，大脑皮层的锥体神经元是由放射状胶质细胞产生。

这一挑战性结论打破了人们以往固有的观念，也使我产生了胆碱能神经元可能来源于放射状胶质细胞的想法。为证实此判断，必须证明U．B．Schambra在端脑侧脑室区发现正在进行有丝分裂又同时表达ChAT的细胞是放射状胶质细胞。

于是，一个实验设计方案油然而生，免疫细胞化学方法对细胞类型的鉴定比其他方法有更大优势，尤其是对神经系统发育过程中分化不同的细胞。

如果通过免疫细胞化学双重染色方法证实端脑侧脑室区正在进行有丝分裂的细胞既表达ChAT又表达vlmentln，将会为结论提供主要证据。实验设计选择了胚胎14天大鼠，即神经元发生高峰期，在端脑冠状切片上对ChAT和vimentin实施免疫组织化学双重染色，同时在体外培养端脑细胞，以同样的方法对ChAT和vimentre免疫细胞化学双重染色。

尽管实验中遇到一些困难，但是在研究小组的不懈努力下终于完成了这次实验，并得到令人兴奋的可喜结果。我们又以此结果为线索开始了对放射状胶质细胞如何获得胆碱能表型的探索。