荧光的淬灭及抗淬灭
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荧光的淬灭及抗淬灭
1)荧光的淬灭：
荧光淬灭(quench)是指荧光分子由内部因素和外部因素同时作用造成的不可逆破坏。内部因素主要是分子从激发态回到基态以非辐射跃迁形式释放能量。外部因素则包含多方面，主要有：
①光照射是致荧光淬灭的最常见原因，荧光的产生需要光照射，但同时光照射也会促进激发态分子与其他分子相互作用而引起碰撞，使荧光淬灭；
②荧光物质的分子与外部分子(或离子)形成非荧光的化合物；
③共振能量的转移；
④溶剂种类、pH值及温度等环境条件。
激光照射下的荧光淬灭曲线图
能够引起荧光淬灭的物质称淬灭剂。如卤素离子、重金属离子、具有氧化性的有机化合物(硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物和羟基化合物)及氧分子等。
2)荧光的抗淬灭：
标记样品的荧光淬灭是在荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察时遇到的主要问题。由于激光扫描共聚焦显微镜具有更强的功率和聚焦更准确的光束，与普通荧光显微镜相比，标本的光漂白作用更为明显，荧光素的荧光可在连续观察过程中逐渐减弱或消失。
因此，应考虑使用抗荧光淬灭剂(抗荧光衰减剂)。常用抗荧光淬灭剂有P-苯二胺(Para-phenylene diamine，PPD)、n-丙基没食子酸盐(propyl gallate，NPG)、1，4-二偶氮双环[2，2，2)-辛烷(1，4-diazobicyelo(2，2，2)-octane，DABCO)等。其中p-苯二胺是最有效的抗淬灭剂，但由于对光和热均有较强的敏感性，且具有毒性，因而限制了在体内的应用。
理想的PPD抗淬灭剂混合液配方是：9份甘油、1份PBS和浓度在2～7retool/L之间的PPl)，最终pH为8．5～9．0。n-丙基没食子酸盐无毒性，对光和热稳定，但抗荧光漂白的效果不如PPl)，可用于体内研究。推荐浓度为3～9retool/L，用甘油配制效果较好。l，4-二偶氮双环C2，2，2)-辛烷是一种稳定的非离子性抗淬灭剂，价格便宜且易使用，可用于体内研究。
此外，还有其他的抗荧光淬灭方法也能使活性细胞或非活性标本荧光强度得到增强，如使用中密度滤片、采用高数值孔径物镜和相对较低的放大倍数等。
