抗体抗原实验

常用的培养基配方如下：1． 配方一 蛋白胨 10.00g葡萄糖 1.00g氯化钠 3.00gNa2HPO4·12H2O 2.00g牛肉浸液(或5% ...

原理 标记抗体法虽然具有许多优点，但也存在一些难以克服的问题，如标记抗体的分子增大，对细胞膜和组织的穿透力减弱；化学交联反应对抗体和酶的活性有所影响；结合物中未标记的抗体可与抗原竞争结合，影响检测方法的敏感性等。不标记抗体法可以避免上述的不利影响因素，通过一系统的非标记抗体的免疫学反应，对组织中的抗原进行定位检测。不标记抗体法又可分为用标记物显示和不同标记物显示两种方法。前者利用基因工程方法制备双 ...

金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal Protein A、简称SPA)是细胞壁抗原的主要成分，几乎90%以上的菌株均含有这种成分，但不同的菌株含量差别十分悬殊。SPA占整个细胞壁蛋白成分的6.7%，通过胞壁肽聚糖以共价键与之结合。其它葡萄球菌如表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌不含SPA。 SPA的理化性质 SPA是一种蛋白质由亮、缬、脯、丙、苏、甘、丝、谷丙、天门冬及赖氨酸等十种氨基酸组 ...

原理 免疫铁蛋白技术是以铁蛋白标记抗体，再以铁蛋白抗体与待检抗原作用。通过电镜检查，观察到铁蛋白抗体所在的位置，即抗原所在。 材料与试剂1．马脾铁蛋白2．硫酸铵3．硫酸镉4．双异氰酸镉二甲苯(Metaxylene dlisocyante XC)以0.30Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲液将XC配制成1%溶液。注意配制的水及容器必须特别清洁，配制后放置4℃数天，以不出现沉淀为准。如出现沉淀XC ...

原理 酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物的反应形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。 材料与试剂1．PBS液 取NaCl 8.5g，Na2HPO40.85g，KH2PO40.54g，加水至1 000ml即可。2．DAB溶液 取5mgDAB(3、3二氨基联苯胺)加入10mlTris－HCl缓冲液(0.05mMol/L pH 7.6)，加1%H ...

原理 免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以 ...

原理 免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学。它主要分为两大类：一类是免疫凝集电镜技术，即采用抗原抗体凝集反应后，再经负染色直接在电镜下观察；另一类则是免疫电镜定位技术。该项技术是利用带有特殊标记的抗体与相应抗原相结合，在电子显微镜下观察，由于标准物形成一定的电子密度而指示出相应抗原所在的部位。免疫电镜的应用，使得抗原和抗体定位的 ...

铁粉吸附法1．材料及试剂（1）铁粉或羰基铁粉（Atomergic chemetals）99％的纯度，颗粒小于60µm（Goodfellow Metals）。（2）强磁铁（马蹄形）。（3）一块小棒状磁铁（约1cm长）。（4）毛细吸管等。2．操作方法（1）称取一定量的铁粉，一般为10g，用100ml生理盐水洗涤4次，去除任何可溶性有毒物质。在倒去盐水时，用强磁铁吸住铁粉。（2）用50ml生理盐水混悬铁 ...

在体外进行细胞免疫检测时，首先必须进行淋巴细胞的分离。分离淋巴细胞的方法很多，但不管采用哪种方法，均要求分离的淋巴细胞纯度高、产量多，而且不丧失活性，同时也要求分离技术简单、操作方便。外周血液中红细胞和白细胞的比例在几百甚至上千比一，两类细胞的大小和密度不同，其沉降速度也就不同。红细胞的自然沉降率较快，加入高分子量的聚合物，如明胶、右旋糖酐等还可以加速其凝聚。利用自然沉降法、密度梯度离心法或二者结 ...

抗酶抗体的优点，在于酶和抗体结合时，不需要通过化学交联剂交联，抗体的失活少。在酶复合物形成后，同时就具有酶的活性，遇到相应的底物即呈现催化显色作用。必须注意，抗酶抗体必须用与第一抗体同种来源的动物制备。于家兔的两个后足掌内各注入弗氏完全佐剂(含活卡介苗12mg/ml)和过氧化物(5mg/ml)的等量混合乳化液0.5ml，两星期后，于两侧腘淋巴结内注入同样液体。一周后静脉注射0.2ml~0.4ml， ...

1．标记酶的选择条件⑴ 活性高，分解底物的能力强。⑵ 特异性强，即作用于底物的专一性强。⑶ 与抗原抗体结合后仍保持酶的活性。⑷ 与底物作用可以显色。⑸ 纯度高、易纯化，即含杂蛋白少。⑹ 可溶性(水溶性)好，在溶液中稳定。⑺ 测定方法简单。⑻ 酶来源方便、价格低廉。2．符合条件的酶⑴ 辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase HRP)，分子量40 000。⑵ 碱性磷酸酶（Alka ...

保存当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。另外在长期的培养过程中，难免不发生污染以至于毁灭。所以必须冷藏保存一部分。保存方法如下：1．材料(1) 细胞：取对数生长期的细胞。(2) 10％二甲基亚砜保护液（二甲基亚砜能损坏滤器，而又被高压所破坏，所以不能过滤或高压消毒。其本身就是毒 ...

交联法交联法通常用的交联剂是戊二醛，戊二醛商品大多为25%的水溶液，利用戊二醛分子上对称的两个醛基，分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记。标记时应尽量采用新鲜纯品，当戌二醛的OD235nm/OD280nm＜3时，即为好的交联剂。戊二醛交联法又分为一步法和二步法。⑴ 一步法：即把酶、戊二醛和抗体一起加入进行交联。然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶结合物。由于抗体 ...

经HAT选择培养基培养10～14天，未经融合的骨髓瘤细胞相继死去，而杂交瘤细胞即可逐渐长成细胞集落。停用HAT液后，改用HT培养基。当细胞集落面积超过培养孔的1／10以上时，即可用敏感的免疫学方法检测出阳性孔。连续三次检测逐渐升高或维持在同一水平者，则可以做克隆化，一部分则冷藏起来做长期保种用。 ...

经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间一般说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。克隆化的阳性杂交瘤细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以需要再次或 ...

用检测抗体的方法从杂交细胞中筛选出生产指定抗体的杂交株是很重要的。检测抗体的方法很多，从沉淀反应到放射免疫测定。由于细胞培养液中的抗体浓度通常是很低的，而且传统的检测方法多是以多价抗原与多克隆抗血清相反应。杂交瘤产生的抗体则是单克隆的，所以并不是每项方法都能适用。一定要选择敏感的、快速的、一次又能检测多份样品的方法。常用的检测方法如下：１．试管溶血反应检测法（1）材料：①杂交瘤细胞，换液后至少两天 ...

原理 转移电泳是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出的蛋白质谱直接转移到硝酸纤维膜上，而形成固定相，并同时排除各种干扰物质，保持其天然构象和生物学活性，完成在凝胶中难以进行的各种生物试验。 材料1．琼脂糖2．丙烯酰胺3．甲叉双丙烯酰胺4．十二烷基磺酸钠（SDS）5．硝酸纤维膜滤纸 孔径0.45μm6．琼脂糖凝胶电泳缓冲液 0.89mMol/L Tris—89mmol/L 硼酸—2.5mMol/L ...

动物的选择 目前应用最广的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠为好。就品系而言以Balb/c小白鼠应用最广，因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从Balb/c小白鼠系诱导出来。Balb/c系小白鼠必须用纯系的，雌雄均可，以8~12周龄为宜。 大白鼠也可，能产生较多量的单克隆抗体。现在已经在小鼠杂交瘤的基础上，发展了小鼠－大鼠，小鼠－人以及人－人杂交瘤技术。 免疫 一般而言，抗原的纯度不很重要，特别 ...

融合剂细胞融合的方法有物理法，如电融合、激光融合，化学融合法和生物融合法，如仙台病毒，此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。聚乙二醇（PEG），在分子量为200～700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1 000时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许多化学药品不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4 000者，常用浓度为50％，pH8.0～p ...

原理 应用荧光素标记的抗体或抗原进行免疫沉淀反应，然后置于荧光显微镜下观察。此法有利于微量可溶性抗原的检查和鉴定。 材料与试剂配制1．荧光素标记抗体（或抗原）2．待测可溶性抗原（或抗体）3．醋酸纤维膜（10cm×2.5cm）4．0.05Mol/L pH8.2巴比妥缓冲液5．洗涤液 pH10.0的巴比妥缓冲液。6．液体石蜡 操作方法1．取5μl待测抗原进行膜电泳（见醋酸纤维膜电泳一节）电压6 ...