1 ．标记酶的选择条件
⑴ 活性高，分解底物的能力强。
⑵ 特异性强，即作用于底物的专一性强。
⑶ 与抗原抗体结合后仍保持酶的活性。
⑷ 与底物作用可以显色。
⑸ 纯度高、易纯化，即含杂蛋白少。
⑹ 可溶性 ( 水溶性 ) 好，在溶液中稳定。
⑺ 测定方法简单。
⑻ 酶来源方便、价格低廉。
2 ．符合条件的酶
⑴ 辣根过氧化物酶 (Horseradish peroxidase HRP) ，分子量 40 000 。
⑵ 碱性磷酸酶（ Alkaline phosphatase AKP ），分子量 82 000 。
⑶ β- 半乳糖甙酶（β-galactosidase ），分子量540 000 。
⑷ 葡萄糖氧化酶（glucose oxidase ）, 分子量186 000 。
其中以HRP 最为常用，因其具有活力高、稳定、分子量小、易提纯等优点。
3 ．辣根过氧化物酶 HRP 广泛地分布于植物界，以辣根中含量最高。它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉辅基组成的一种糖蛋白，含糖量 18% ，它由 300 个氨基酸和 4 个二硫键连接而成。分子量 40 000 ，等电点 5.5 ～ 9.0 之间，它催化的最适 pH 因供氢体不同而有所差异，但多在 pH5.0 左右。 HRP 易溶于水和 58% 以下的饱和硫酸铵溶液。
HRP 酶蛋白和其它杂蛋白的最大吸收光谱为 275nm ，辅基部分的最大吸收光谱为 403nm ，二者比值 OD403 /OD275 为酶的纯度。以 RZ 值 (Reinheit Zabl 德文 ) 表示。 RZ ＞ 3 为高质量， RZ ＞ 2.5 为中等质量， RZ ＜ 2.5 则需要纯化。 RZ 值越小，表示杂蛋白越多 , 如 RZ 为 0.6 ，则表示有 75% 的杂蛋白。
衡量酶质量的标准有两条，一个是纯度即 RZ 值，一个是活力。只用酶的纯度表示是不全面的。目前国际上规定 , 酶的活力以国际单位表示。一个酶单位是在一定的条件下 (pH 、温度和底物浓度 ) 一分钟能降解 1mMol/L 底物的酶活力。 1mg 酶所含有酶的单位数称为比活性。用比活性进行酶的比较。
用作标记的过氧化物酶活性一般要大于 250units/mg 。
4 ． HRP 的作用底物与供氢体 底物为 H2 O2 ，催化时需供氢体。
⑴ 组化法常用的供氢体是 3 ， 3′ －二氨基联苯胺盐酸盐 (3.3 － diamino － benzidine . DAB) 。其反应物由于形成的氧化型中间体迅速聚合，形成不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用于光学显微镜观察。这种多聚物能还原和螯合四氧化锇 (OS O4 ) 形成具有电子密度的产物，可适用于电子显微镜观察。
⑵ 用于 ELISA 的供氢体有下列数种。
表 ELISA 的供氢体
|
供 氢 体 |
反应颜色 |
波长 |
终止剂 |
终止 颜色 |
测定波长 |
|
联大茴香胺 (OD) |
桔红 |
512 |
5Mol/L HCI |
黄 |
400 |
|
邻苯二胺 (OPD) |
黄 |
444 |
2Mol/L H2 SO4 |
桔黄 |
492 |
|
邻苯甲苯胺 (OT) |
兰 |
636 |
2Mol/L H2 SO4 |
黄 |
442 |
|
5 －氨基水杨酸 |
褐 |
475 |
1Mol/L NaOH |
褐 |
449 |
以 OD 和 OPD 最为常用。 OPD 有致癌作用，使用时需注意。
5 ．碱性磷酸酶 可从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取。它是一种磷酸脂酶 , 其作用是催化磷酸－脂水解释放出无机磷酸而显色。或者通过水解产生的磷酸与钼酸反应生成磷钼酸，然后在还原剂作用下生成蓝色的产物进行测定。
