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        非标记抗体免疫电镜

        互联网

        1301

        原理

         

        标记抗体法虽然具有许多优点,但也存在一些难以克服的问题,如标记抗体的分子增大,对细胞膜和组织的穿透力减弱;化学交联反应对抗体和酶的活性有所影响;结合物中未标记的抗体可与抗原竞争结合,影响检测方法的敏感性等。不标记抗体法可以避免上述的不利影响因素,通过一系统的非标记抗体的免疫学反应,对组织中的抗原进行定位检测。不标记抗体法又可分为用标记物显示和不同标记物显示两种方法。前者利用基因工程方法制备双特异性抗体的 F(ab )2 ,一个 Fab 片段与标本中的抗原结合,一个 Fab 是抗体蛋白的结合片段。在抗体与标本作用后,再加入铁蛋白与抗体结合,从而显示组织内抗原的所在部位。后者则用磷酸钨负染后,直接电镜观察。

         

         

         

        材料及试剂

         

        1 .待检病毒材料 如粪便,气管分泌物、脑脊髓液、组织培养液等。

        2 .高速离心机

        3 .已知抗体

        4 .磷钨酸

        5 .琼脂糖

        6 .其它

         

         

         

        操作方法

         

        1 .经典法

        1 )将被检病毒材料 0.9ml ,加 1 5 1 10 稀释的特异性免疫血清 0.1ml 充分混合。

        2 )置 37 作用 1h 37 1h 后再置 4 过夜。

        3 )以 17 000r/min 23 000r/min 离心 90min

        4 )吸去上清,将离心管口倒置于滤纸上,吸去残留液体。

        5 )沉淀物中加少量 H2 O 混悬,用 3% 磷钨酸 (pH6.0) 负染 20Sec 30Sec ,滴加于 400 目铜网 Fomnvar 膜上,用滤纸从铜网边缘轻轻吸去多余的负染液。

        6 )在透射电镜下 4 × 104 倍观察。

        2 .快速法 ( 琼脂扩散法 )

        1 )同经典法 (1) (2) 步骤,制备免疫复合物。

        2 )以生理盐水或 pH 7.2 巴比妥缓冲液制备 1% 琼脂糖,趁热浇注于洁净的载玻片上,每片 3ml ,待冷却凝固后,在凝胶面上等距离放置直径 4mm 玻璃珠数粒,再于凝胶面上浇注 1% 琼脂糖 2ml 3ml ,冷却凝固后,取出玻璃珠,使凝胶形成凹孔。

        3 )将普通滤纸剪成 2 × 3cm 大小, 3 4 层重叠。用小刀将带有凹孔的琼脂糖切成小块 , 每块带有一个凹孔 , 平放在滤纸上。

        4 )在凹孔内,加入制备好的含病毒的免疫复合物悬液。

        5 )将电镜载网的 Fomnvar 膜面向下倒悬于液滴上。由于琼脂糖的吸水作用, 20min 30min 后,可将液滴的水分吸干,而浓缩的免疫复合物则粘附在载网膜上。

        6 )在载网膜上滴加 3% 磷钨酸负染 20Sec ,过量的负染液用滤纸在载网边缘轻轻吸去。

        7 )于透射电镜 4 × 104 倍下观察。

         

         

         

        结果判定

         

        直接观察病毒粒子的形态。由于离心浓缩的处理和特异性抗体的加入,大大提高了观察的敏感性。

         

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