单克隆抗体技术：杂交瘤细胞的保存

保存

 

当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。另外在长期的培养过程中，难免不发生污染以至于毁灭。所以必须冷藏保存一部分。保存方法如下：

1 ．材料

(1) 细胞：取对数生长期的细胞。

(2) 10 ％二甲基亚砜保护液（二甲基亚砜能损坏滤器，而又被高压所破坏，所以不能过滤或高压消毒。其本身就是毒品，无菌）：含 10 ％二甲基亚砜、 20 ％灭活胎牛血清， 70 ％ RPMI — 1640 液。

(3) 20 ％ FCS — 1640 培养液：含青霉素 100U/ml ，链霉素 100 μ g/ml 。

(4) 灭菌的 2ml 安瓶等

2 ．操作方法

(1) 去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入 10 ％ FCS — 1640 液，使细胞悬浮。

(3) 1 000r/min 离心 10min ，去上清。细胞沉淀用 10 ％二甲基亚砜保护液制成悬液，使成 1.0 × 10⁷ 细胞／ ml 。

(3) 取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在 95 ％以上。

(4) 用注射器将细胞分装安瓶，每瓶 0.5ml ～ 1.0ml ，熔封安瓶。

(5) 放 4 ℃ 2h 。

(6) 放液氮罐气态部分（ -70 ℃ ） 15h 。

(7) 转入液氮部分。

 

 

 

复苏

 

1 ．从液氮罐中取出安瓶立即放 37 ℃ 水浴中速溶。

2 ．无菌操作打开安瓶，取出细胞悬液，转入组织培养瓶。

3 ．逐滴缓慢加入 20 ％ FCS － 1640 培养液 3.5ml ，这个过程延续 3min 。

4 ． 5 ％ CO₂ 饱和湿度， 37 ℃ 培养。

5 ． 4h 后弃去培养液上清，加入新鲜的 20 ％ FCS － 1640 培养液。

6 ．继续培养，换液，以至形成单层。