抗体抗原实验

ScFv表达载体pFUW80的基因图谱 由于单链抗体可以在大肠杆菌中正确装配、表达，而抗体片段在大肠杆菌中的表达具有规模大、速度快和成本低的优点，目前主要利用原核的大肠杆菌表达载体表达单链抗体。 单链抗体基因的设计应设计理想的连接序列(linker)，以保证VH和VL在表达系统中能等摩尔地产生，不干扰VH和VL的自由折叠，并使抗原结合位点处于适当构型，不引起分子动力学改变，尽可能 ...

嵌合基因的构建（RT-PCR方法扩增VL、VH基因）【材料和试剂】(1) 分泌McAb的杂交瘤细胞(如分泌抗转铁蛋白受体的杂交瘤细胞株)。(2) 细胞培养常用试剂、培养液、器皿。(3) 总RNA提取试剂 Trizol Reagenz。(4) cDNA合成试剂盒。(5) DNA提取试剂及分子生物学技术所需其他试剂和溶液。(6) 核酸修饰酶类：T4DNA连接酶、TaqDNA聚 ...

抗人肺腺癌单链抗体的构建 (1)将表达载体pFUW80质粒经XbaI和EcoRI双酶切，同样双酶切在pUC19中克隆的VL基因，分别回收后，连接并转化大肠杆菌JM109株，鉴定阳性重组子(可通过XbaI、EcoRI双酶切切下合适大小的带，即VL片段)。 (2)将上述经过鉴定的重组质粒用XhoI、SpeI双酶切，回收后，与同样双酶切的在pUC19中克隆的VH基因相连，再次转化JM10 ...

抗体的轻、重链嵌合基因共转染受体细胞目前将重组子导入宿主细胞主要采用的方法有磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖街道法介导法、聚季铵盐介导法、原生质体融合法、电转染法以及微注射法。其中以电转染效率较高。【材料和试剂】（1） 小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0细胞或P3X63.Ag8.653细胞，或CHO细胞。（2） 已构建的轻、重链嵌合基因质粒DNA。（3） 脂质体。（4） ...

抗体库技术 抗体库技术的主导思想是将某种动物的所有抗体可变区基因克隆在质粒或噬菌体中表达，利用不同的抗原筛选出携带特异抗体基因的克隆，从而获得相应的特异性抗体。 从抗体库中筛选多种重要的抗体，如膜蛋白抗原、自身抗原、病毒抗原的抗体。这些显示出抗体库技术的应用潜力。 抗体库技术不仅可以模拟动物免疫系统产生抗体的过程，还具有许多独特的优点，令杂交瘤技术难以相比。抗体库技术无需免 ...

基因工程抗体细胞质表达 胞内表达抗体主要采用高表达方式，其表达结果因抗体片段的不同而有较大差异，主要取决于翻译起始位点的设计、片段对蛋白酶的敏感性和宿主菌。高表达抗体的结果常常是以包涵体(inclusion body)形式存在，除载体方面的原因外，这可能与抗体表面疏水性强有关。包涵体可以防止宿主对抗体的降解，并利于纯化。经过变性、复性及去除蛋白的N端甲酰甲硫氨酸或甲硫氨酸，可以得到重新折 ...

基因工程抗体分泌型表达 在表达载体上装入信号肽序列，可以使抗体片段分泌到细胞外或周质腔。在表达时抗体完成切断信号肽，蛋白质折叠，二硫键形成，重、轻链的正确装配等一系列过程，能形成有活性的抗体分子。信号肽可利用已知的PelB以及碱性磷酸酶(PhoA)；外膜蛋白A(OmpA)；A-溶血素蛋白(HlyA)等，将抗体基因两条链分别融合到一种或两种信号肽后面，或者同时融合到同一种信号肽后面。融 ...

基因工程抗体抗体的纯化 对于表达的抗体需要纯化才能准确地进行活性、亲和力的鉴定及应用于临床研究。基因工程抗体的纯化方法与通常抗体纯化方法基本相同。本文主要介绍利用IMAC方法纯化。IMAC的方法原理是利用组氨酸的咪唑基能与二价金属离子，如Cu2+、Zn2+、Ni2+等发生螯合作用，在表达载体的抗体基因插入位点后面设计5～6个组氨酸，这并不影响抗体正确折叠成活性分子，经过一步洗脱，得到 ...

影响免疫亲和层析纯化效果的因素 多种因素影响免疫亲和层析纯化效果，其中最关键的三个因素是：抗原的初始纯度，抗原与抗体的亲和力，以及抗原抗体结合是否容易发生解离。 在免疫亲和层析技术中，抗原的初始相对浓度（即纯度）是决定最终产物纯度极为重要的因素，因为抗原-抗体的反应具有相当高的特异性，还没有任何其他一种层析技术能经过一步纯化得到如此高的纯度。然而，纯化的程度不是无限的，免疫亲和层析 ...

免疫亲和层析使用的抗体的选择 通过实验比较和经验积累才能发现最适合用于免疫亲和层析的抗体（见表2-1）。这意味着没有轻而易举的捷径能选择到最佳的抗体，最好的方法就是进行预实验，来初步测试这些抗体的效果。可用不同的共价交联微珠进行免疫沉淀试验，然后通过免疫印迹法测定结合的抗原量；另一种方法是将抗原溶液通过小型层析柱，然后用免疫印迹的样品缓冲液进行洗脱。一旦确定与抗原结合性能良好的抗体后，下一 ...

免疫亲和层析的基本过程一．概要 对蛋白质（抗原）的纯化率为1000~10000倍 快速纯化抗原，层析柱一般可重复使用 可获得纯化的抗原 不能用于定量测定 纯化效果取决于待纯化抗原的浓度和抗体的亲和力 需要适当纯化的抗体二．操作步骤　基本步骤为：交联 → 结合 → 洗脱（一）交联 1.将抗体结合到蛋白A或蛋白G微珠上。一般情况下，每毫升湿的微珠大约可以结合2mg单 ...

多克隆抗体和单克隆抗体的比较 免疫亲和层析技术使用单克隆抗体或经过亲和层析纯化的多克隆抗体。在某些情况下，可用未纯化的多克隆抗体，但一般不使用混合的单克隆抗体。1、应用多克隆抗体进行免疫亲和层析 使用多克隆抗体进行免疫亲和层析有一定的局限性，因为多克隆抗体通常结合抗原分子上的多个表位，虽然亲合力高，但洗脱困难。当一种抗原与多种不同的抗体结合后，需要很苛刻的洗脱条件，通常会损坏抗体层 ...

基因工程抗体活性及亲和力的测定 基因工程抗体活性的测定方法主要采用免疫学的常规手段，如免疫荧光技术，免疫酶技术，放射免疫分析技术(RIA)等。表达的抗体片段如Fv、ScFv、VH等缺少完整抗体的恒定区即Fc段，常规ELISA方法中酶标二抗无法与之直接反应，制备可变区的抗体方法又非常复杂和困难，因此，主要采用免疫竞争抑制法，即通过抗体如ScFv与相应McAb对抗原结合的竞争抑制，间接 ...

活化微珠交联的常见问题与解决方法 虽然将抗体有效地与活性微珠交联是一项简单的工作，主要问题是要保持抗体的活性。抗体失活大多是由于抗体与微珠过度交联，或交联发生在抗体的抗原结合片段，使与微珠交联的抗体结合抗原的能力显著低于未交联的抗体。通常能够保持l0~50％抗体活性，这可认为是活性良好水平。在交联过程中，如果抗体的活性远远低于这一水平，可采取下列三种措施保持抗体活性。 （1）在彻 ...

常用的活性微珠，活化微珠的交联交联机制蛋白质上的结合基团 最终交联的稳定性推荐基质商品举例羰基二咪唑-NH2避免pH10琼脂糖珠交联琼脂糖珠聚丙烯酰胺CM Bio-Gel A Gel(Bio-Rad)ECH Sepharose 4B(Pharmacia)Reacti-Gel 6X(Pierce Chemical)Reacti-Gel GF-2000(Pierce Chemical)溴 ...

抗体-蛋白A或-蛋白G微珠层析柱的制备 蛋白A或蛋白G微珠-抗体层析柱是免疫亲和层析技术中最常用的微珠基质之一。此类层析柱容易制备，由于抗体分子是通过Fc段与微珠基质结合，抗原结合片段（Fab）可与抗原最大限度地发生作用。以下介绍的方法可用于蛋白质抗原的纯化，但类似的方案也适用于任何其他抗原。 抗体可直接与蛋白A或蛋白G结合。根据抗体与蛋白A或蛋白G的亲和力，可以选用蛋白A或蛋白G微 ...

常用交联剂交联剂化学名同源或异源双功能反应基团蛋白结合基团光激活性间隔臂长(A)DMA二甲基二亚胺酯同源亚胺酯-NH2N8.6DMP二甲基亚胺酯同源亚胺酯-NH2N9.2DMS二甲基苯二酸亚胺酯同源亚胺酯-NH2N11DSG琥珀酸辛二酸戊二酸盐同源N-羟基琥珀酰亚胺-NH2N7.7DSS琥珀酸辛二酸二亚胺同源N-羟基琥珀酰亚胺-NH2N11.4BMH马来酰亚胺己烷同源马来酰亚胺-SH2NMBS ...

抗原与抗体-微珠基质的结合 虽然使抗原有效地结合到免疫亲和柱上的方法很多，因为抗体是通过共价键交联在微珠上，而不是游离于溶液中，所以交联在微珠上的抗体与抗原结合所需的时间比抗体和抗原二者以游离状态在溶液中所需的时间要长得多，因此，选用的方法应使抗原与交联的抗体达到最大程度的结合。推荐使用两种结合方法：将抗原溶液加入呈糊状的抗体-微珠内，不断混和均匀；或将抗原溶液流经抗体-微珠层析柱，保持抗 ...

在混悬液中结合：抗体-微珠匀浆法 这是一种使抗体-微珠基质快速捕获抗原的方法，将抗原溶液与微珠混合，搅拌或振荡制成匀浆。这种方法可使抗原与固相化的抗体最大限度地接触。结合反应完成后，将匀浆装入层析柱内，以便收集结合有抗原的抗体-微珠和洗脱抗原。此法可以很好地控制反应时间，充分的利用了抗体结合容量。这比上面介绍的直接用层析柱捕获抗原方法麻烦一些。主要是因为用匀浆装柱比较困难；另一个问题是在混 ...

抗原结合到抗体-微珠基质层析柱上 为了将抗原结合到抗体微珠基质上，最简单方法是将微珠装到一个层析柱内，再将抗原溶液流经层析柱，当抗原流经层析柱时结合到抗体上而被固定，直到洗脱时才洗脱下来。这种方法的效率取决于抗原与固定的抗体之间的接触时间，通过控制流速，可以改变抗原抗体之间的作用时间。【准备工作】 开始前，要考虑层析柱的类型和尺寸。一般来说，粗而矮的柱子比细而高的柱子容易获得陡峭的 ...