免疫学技术

当蛋白质的最适稳定量及标记的最佳pH值被确定以后，便可进行标记。具体步骤如下：（1）根据标记所用胶体金的总量计算出所需要待标记蛋白质的总量。

胶体金标记蛋白质的纯化:标记好的免疫金探针必须经过纯化处理才能用于IHC染色，尤其是免疫电镜的染色。纯化的目的就是除去其中未标记的蛋白质，未充分标记的胶体金及在标记过程可能形成的各种聚合物。其纯化方法有超速离心法、色谱柱法以及以上二者相结合应用。

本法是由Geoghegan等（1978）首次应用金标探针检测B淋巴细胞表面抗原，将胶体金颗粒（大于20nm）标记在第二抗体或SPA分子上，制备成金标二抗。

免疫金银染色（IGSS）操作流程：做冰冻切片的组织可先经过固定再作切片，也可先制作冰冻切片，然后再固定。这要根据保存抗原的需要而定，固定过的组织可用含20%蔗糖的PBS（0.1mol/L,pH7.4）浸泡过夜，使切片减少冰结晶，保持组织细胞良好的形态结构。

免疫金银染色方法敏感、简便、省时、安全可靠，葡萄球菌A蛋白（SPA）金标记四步法是在此基础上发展起来的更为敏感的一种新方法。SPA和许多哺乳类动物IgG具有亲和性，且它们之间的连接不会干扰抗原-抗体的结合。

彩色免疫金银染色方法的基本原理是在IGSS法的基础上，根据洗彩色照片的显影原理而发展起来的，即IGSS后，在抗原位点处生成的银颗粒经铁氰化钾与溴化钾的氧化反应，将银颗粒氧化成溴化银，后者与彩色显影剂起还原反应，生成金属银，而彩色显影剂本身则被氧化，其氧化产物使彩色成色剂由五色变成有色的染料，并沉积在银颗粒的部位，金属银变成了银离子。由于染料只能通过彩色显影剂沉积在有银的部位，不会发生非特异性背景染色。

转印到纸上的蛋白质抗原，可与其专一性抗体结合，再以二次抗体-酶结合体（2nd Ab-HRP） 或Protein A-HRP 呈色；可在一群转印色带中，专一性地挑出目标蛋白质，是最有用的检定工具 （Burnett,1981）。

感冒的免疫过程。

免疫荧光显微法：溶液准备：PBS（pH7.4）：10mM Na2HPO4 ,1.8mM KH2PO4,50mM NaCl,2.7mM KCl实验步骤：1 . 用盖玻片将12孔板盖上，细胞培养至50%浓度。2 . 将培养液倒掉并用PBS清洗两次。……

免疫共沉淀方法：溶液准备：RIPA缓冲液：50mM Tris-HCl pH7.4 ,150mM NaCl ,1mM EDTA,1%Triton×100,1%去氧胆酸钠，0.1%SDS,1mM PMSF,1μg/ml 牛胰蛋白酶抑制剂 （ aprotinin ） , 1μg/ml亮抑蛋白酶肽 （ leupeptin ）。PBS （ pH7.4 ） :10mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4 ,50mM NaCl ,2.7mM KCl。1×样品缓冲液：65mM Tris-HCl （ pH8.0 ），10% （ v/v ） 甘油，2.3%（w/v） SDS,0.01% 溴酚蓝，1% DTT

百奇生物的免疫组织化学（HRP-DAB系统）：1. 溶液准备：PBS （ pH7.4 ） :10mM Na2HPO4 ,1.8mM KH2PO4 , 50mM NaCl , 2.7mM KCl封闭缓冲液：3%BSA-PBS2. 程序：1 ） 对石蜡切片进行脱蜡和水化：3×10min 二甲苯，5min 100%乙醇，5min 95%乙醇，5min 80%乙醇， 5min 70%乙醇，3×5min PBS.……

夹心ELISA溶液准备： 包被液：50mM Na2CO3（ pH9.6 ）， 20mMTris-HCl( pH8.5 ） 或10mM PBS （ pH7.2 ）封闭液：一般封闭用BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶等洗涤液：0.02-0.05%Tween-20的0.1M磷酸盐缓冲液或者Tris盐缓冲液 （ pH7.4 ）AKP偶联的链球菌亲和素溶液：用1×封闭液稀释酶偶联物

间接ELISA溶液准备：包被液：50mM Na2CO3 （ pH9.6 ），20mMTris-HCl （ pH8.5 ） 或10mM PBS （ pH7.2 ）封闭液：一般封闭用BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶等洗涤液：0.02-0.05%Tween-20的0.1M磷酸盐缓冲液或者Tris盐缓冲液（ pH7.4 ）

用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1:1混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。每个区域大约用1/4的免疫原。这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。

实验动物免疫方案：1、抗原： 蛋白质、多肽、细胞器、细胞、组织等。2、免疫方式：皮下注射、腹腔注射、静脉注射、肌肉注射等。3、不同动物免疫所需抗原量（以蛋白免疫为例）。

1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

免疫组化是应用免疫学基本原理--抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 （荧光素、酶、金属离子、同位素） 显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术（Immunohistochemistry）或免疫细胞化学技术（Immunocytochemistry）。

免疫组化是应用免疫学基本原理--抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 （荧光素、酶、金属离子、同位素） 显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术（Immunohistochemistry）或免疫细胞化学技术（Immunocytochemistry）。

免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。

猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)是正粘病毒科单股负链RNA病毒, 引起猪群发生严重的呼吸系统 疾病, 给养猪业造成很大的经济损失。而且, 猪是人流感病毒和禽流感病毒发生重组的‘混合器,’, 因此, 研究猪流感 病毒对于搞清人流感病毒和禽流感病毒的变异, 致病机理、流感的预防和控治都有重要的意义。