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        免疫组化实验方法

        互联网

        40628

        一、免疫组化(Immunohistochemistry,IHC/ Immunocytochemistry, ICC)原理

        免疫组化是应用免疫学基本原理--抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学技术(Immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(Immunocytochemistry)。

        众所周知,抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性,即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来,以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物,制备特异性抗体,再用这种抗体(第一抗体)作为抗原去免疫动物制备第二抗体,并用某种酶(常用辣根过氧化物酶)或生物素等处理后再与前述抗原成分结合,将抗原放大,由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的,因此,还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来(常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒)。

        通过抗原抗体反应及呈色反应,显示细胞或组织中的化学成分,在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物,从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质,如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。

        免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。

        用于病理诊断的主要有免疫荧光法和免疫酶法。免疫荧光法是现代生物学和医学中广泛应用的方法之一,包括荧光抗体和荧光抗原技术,具有抗原抗体反应的特异性,染色技术的快速性,在细胞或组织上定位的准确性,以及荧光效应的灵敏性等优势。

        但是,由于免疫荧光法必须具有荧光显微镜,荧光强度随时间的延长而逐渐消退,结果不易长期保存等缺点,在普及应用上受到一定限制,而逐渐被免疫酶法所取代。

        二、IHC/ICC实验方法

        1、仪器设备

        (1)18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉;

        (2)水浴锅。

        2、试剂

        (1)PBS缓冲液(pH7.2~7.4):NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L。

        (2)0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(CB,pH6.0,1000ml):柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g。

        (3)0.5mol/L EDTA缓冲液(pH8.0):700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O,用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。

        (4)1mol/L的TBS缓冲液(pH8.0):在800ml水中溶解121gTris碱,用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。

        (5)酶消化液: a、0.1%胰蛋白酶液:用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液:用0.1N的HCl配制。

        (6)3%甲醇-H2O2溶液:用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

        (7)封裱剂:

        a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.0~9.5)等量混合;

        b、油和TBS(或PBS)配制。

        (8)TBS/PBS pH9.0~9.5,适用于荧光显微镜标本;pH7.0~7.4适合于光学显微镜标本。


        3、操作流程

        (1)脱蜡和水化

        脱蜡前,应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

        1)组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后再浸泡10分钟;

        2)无水乙醇中浸泡5分钟;

        3)95%乙醇中浸泡5分钟;

        4)70%乙醇中浸泡5分钟;

        (2)抗原修复

        用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。

        1)抗原热修复

        在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)。盖上不锈钢高压锅的盖子,但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上,缓慢加压,使玻片在缓冲液中浸泡5分钟,然后将盖子锁定,小阀门将会升起来。10分钟后,去除热源,置入凉水中,当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。

        2)煮沸热修复

        电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至95℃左右,放入组织芯片加热10~15分钟。

        3)微波热修复

        在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至沸腾后将组织芯片放入,断电,间隔5~10分钟,反复1-2次。适用的抗原有:AR,Bax,Bcl-2,C-fos,X-jun,C-kit,C-myc,E-cadherin,Chromogranin A,Cyclin,ER,Heat shock protein,HPV,Ki-67,MDMZ,p53,p34,p16,p15,P-glycoprotein,PKC,PR,PCNA,ras,Rb,TopoismeraseⅡ等。

        4)酶消化方法

        常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃,切片也预热至37℃,消化时间约为5~30分钟;胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原,其中有:Collagen,Complement,Cytokeratin,C-erB-2,GFAP,LCA,LN等。

        (3)免疫组织化学染色

        常见的染色方法有两种:SP法,SABC法。以下分别列出两种方法的实验步骤。


        SP法

        1)脱蜡、水化;

        2) PBS洗2~3次各5分钟;

        3)3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上,室温静置10分钟

        4)PBS洗2~3次各5分钟;

        5)抗原修复;

        6)PBS洗2~3次各5分钟;

        7)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。

        8)滴加Ⅰ抗50μl,室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。

        9)4℃过夜后需在37℃复温45分钟。

        10)PBS洗3次各5分钟;

        11)滴加Ⅱ抗40~50μl,室温静置,或37℃1小时;

        12)抗中可加入0.05%的tween-20.

        13)BS洗3次各5分钟;

        14)DAB显色5~10分钟,在显微镜下掌握染色程度;

        15)PBS或自来水冲洗10分钟;

        16)苏木精复染2分钟,盐酸酒精分化;

        17)自来水冲洗10~15分钟;

        18)脱水、透明、封片、镜检。

        SABC法

        1)脱蜡、水化。

        2)PBS洗两次各5分钟。

        3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2,室温封闭5~10分钟,蒸馏水洗3次。

        4) 抗原修复。

        5) PBS洗5分钟。

        6) 滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。

        7) 滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时(4℃过夜后在37℃复温45分钟)。

        8) PBS洗三次每次2分钟。

        9) 滴加生物素化二抗,20℃~37℃20分钟。

        10)PBC洗3次每次2分钟。

        11)滴加试剂SABC,20℃~37℃20分钟。

        12)PBS洗4次每次5分钟。

        13)DAB显色:DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色(镜下掌握显色程度)。

        14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。

        15)脱水、透明、封片、镜检。

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