免疫学技术

PCR-SSP扩增体系的组成和准备（一）SSP引物混合液的准备预先准备好所有引物的混合液，其中包括除Taq多聚酶和待测基因组DNA之外的所有PCR反应成分，即：（1） 2pmol 5’ 末端和3’末端的引物（2） 2pmol 内参照引物（β-actin基因引物）（3） 200umol 各种d-NTP（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）（4） 1 X PCR缓冲液：10mM Tris-HCl ...

HLA-DR基因中等分辨率分型序列特异性引物5’-引物序列(5’ � 3’)3’-引物序列(5’ � 3’)PCR产物长度DRB1基因扩增特异性5’01TTGTGGCAGCTTAAGTTTGAAT3’047CTGCACTGTGAAGCTCGCAC255bp0101-01023’048CTGCACACTGTGAAGCTCTCCA255bp5’01TTGTGGCAGCTTAAGTTTGAAT3 ...

常用HLA DNA分型技术的特点1、PCR-SSOPCR扩增的序列是具有多态性的HLA等位基因外显子，HLA-I类基因主要是第2和第3外显子，HLA-II类基因主要是第2外显子，PCR扩增产物用一组探针进行杂交，每一探针与相应型别的HLA等位基因序列互补。HLA等位基因特异性的探针可以检测已知序列的HLA等位基因。因此PCR-SSO是一种常用而精确的HLA基因分型方法，通常是将多个待测样本的PC ...

抗原特异性T细胞克隆的制备 （一）间歇循环刺激法 是制备抗原特异性T细胞克隆的传统方法，即经抗原间隔刺激多个循环。 【材料和试剂】 （1）抗原致敏供者的单个核细胞(MNC)和经过3300rad照射的自身MNC （2）抗原 （3）含10％人AB型血清的完全RPMI 1640培养液 （4）细胞分离及T细胞培养增殖所需的其他试剂和器材。 【操作步骤 ...

常用HLA DNA分型技术的选用 HLA分型方法的选用首先取决于HLA分型的目的，组织配型中常用的是中等分辨率的分型技术，即分辨出与HLA抗原特异性相对应的HLA等位基因型别，而在某些研究中需要高分辨率的HLA分型，即需要分辨出HLA型别中的各种亚型。上述每一种DNA分型技术的分辨率都高、中、低的区别，在掌握各种分型方法的基本原理的前提下，通过改变SSO探针的组合，或限制性核酸内切酶的组合 ...

T细胞克隆技术 T细胞在机体特异性免疫应答中发挥举足轻重的作用，其特异性识别的靶分子与B细胞（或抗体）明显不同，不是抗原分子上的天然表位，而是由MHC分子提呈的抗原肽（T细胞表位）。由于T细胞识别的这种特点，决定了对其特异性的研究必须考虑抗原肽的性质和提呈抗原肽的MHC分子型别。 T细胞克隆的建立对于T细胞在免疫应答中的功能研究具有重要的意义。由于T细胞上TCR识别的抗原肽需要MH ...

抗原非特异性T细胞克隆的制备 【材料和试剂】 ①PBMC和经过照射的自身PBMC，照射的同种PBMC； ②5μg/ml PHA； ③50U /ml和25U/ml IL-2； ④T细胞分离、培养和计数所需的其他试剂和器材。 【操作步骤】 (1)从PBMC中分离T细胞，将1×105T细胞，5×104经过照射的自身PBMC，10μgPHA和50U IL ...

PCR-SSP结果分析采用SSP进行PCR扩增后，相应的PCR产物是否出现，是HLA分型结果的判断的依据，相应SSP扩增产物出现，表示基因组中存在与特异性引物（即SSP）互补结合的DNA序列，即样本为该SSP结合的HLA基因阳性。当某种SSP引物的扩增管中未出现相应的PCR产物时，应注意观察内参照引物是否出现PCR产物。如果该扩增管的内参照引物出现PCR产物，而无相应SSP扩增产物，说明样本为该 ...

可溶性蛋白抗原特异性Th克隆的制备 与可溶性蛋白抗原反应的特异性Th克隆的制备需体内致敏，以及需要同系脾细胞作为抗原提呈细胞。有两种类型的辅助T细胞，即分泌IL-2的Th1和分泌IL-4的Th2，前者在克隆时需加入IFN-γ。 【材料和试剂】 （1）免疫用动物； （2）蛋白抗原和完全福氏佐剂（CFA）； （3）完全RPMI-1640培养液； （4）生长 ...

同种反应性Th和CTL克隆的制备 鼠T细胞克隆分为同种反应性T辅助细胞(Th)和细胞毒性T细胞(CTL)克隆，以及与可溶性蛋白抗原反应的Th1和Th2克隆。 同种反应性是指未免疫的鼠或人T细胞对同种异体细胞上组织相容性抗原的反应。尽管同种反应性T细胞克隆可从未免疫的脾细胞或淋巴细胞制备，但经同种抗原预刺激的细胞所获反应细胞的频率较高。细胞毒性和非细胞毒性T细胞可经有限稀释进行克隆 ...

HLA-I重链、轻链的制备（包涵体的制备）此步骤是用原核表达的方法制备HLA-I类分子的重链和轻链，其中重链为HLA-A2分子的α链（胞外段，包括α1至α3功能区），轻链为β2微球蛋白。HLA-A2分子的α链的C端连接有BSP（生物素结合部位），该部位是通过基因重组的方法将BSP序列与HLA-I类分子重链基因连接后，经过原核表达而获得。【试剂及配制】（1）LB培养基（2）0.4M IPTG（3 ...

HLA/抗原肽四聚体制备技术 MHC/抗原肽四聚体（tetramer）是借助亲和素-生物素结合的原理，在体外将MHC分子（MHC-I类分子包括β2微球蛋白）及其所提呈的抗原肽组装成的MHC-四聚复合物，作为TCR结合的配体，用于检测和分离特异性T细胞。图11-1是HLA-I/抗原肽四聚体结构示意图。图示由亲和素与四个生物素化的HLA-I类分子抗原肽复合物单体结合后形成的四聚体结构，其中亲和 ...

MHC-I单体的折叠此步骤是将HLA-I类分子的重链、轻链以及抗原肽通过折叠形成完整的HLA-I类分子单体。【试剂及设备】1、试剂及配制（1）折叠缓冲液（PH8.3）400mM L-Arginine(左旋精氨酸)100mM Tris2mM EDTA（2）注射缓冲液（PH 4.2）3M Guanidine HCl（盐酸胍）10mM NaAcetate(乙酸钠)10mM EDTA（3）重 ...

利用HLA/抗原肽四聚体和流式细胞分选仪制备CTL细胞克隆 免疫反应的最显著特点是其特异性，是由于免疫分子与相应的抗原表位结合具有高度特异性。利用免疫反应的特异性，能够分离出抗原特异性的淋巴细胞克隆。B细胞上BCR（或抗体）能够直接识别抗原表位，利用某种抗原表位就可以鉴定和分离相应的B细胞克隆（或抗体），过程相对简单。与B细胞不同，T细胞上TCR识别的配体是抗原肽/MHC分子复合物，而不是 ...

四聚体的制备经上述过程制备的生物素化的MHC/抗原肽复合物为单体分子，通过加入链酶亲和素，一个链酶亲和素分子有4个生物素结合位点，即可以结合4个生物素化的MHC单体分子，形成MHC四聚体。

MHC-I单体的生物素化单体HLA-1类分子必须借助于其他分子的连接才能形成四聚体，一般借助生物素-亲和素将单体HLA-I类分子连接为四聚体，这种连接方式要求HLA-I分子重链C端或轻链上能够与生物素结合。此步骤是在BirA酶（生物素-蛋白连接酶）的作用下，将生物素结合到HLA-I类分子重链的BSP位点上。【试剂及材料】1、 试剂（1）100mM 生物素（Tris-base中）（2）10 ...

浓缩MHC-I单体折叠反应物上述折叠的HLA-I/抗原肽复合物存在于1L的折叠缓冲液中，需要进行浓缩，可以采用超滤进行浓缩。【试剂及设备】试剂与材料：20mM Tris(PH8.0) Biomax 30 membrane设备： 超滤装置（Amicon 500ml Stir Cell） 带有压力调节器的氮气瓶【操作步骤】（1）按照操作程序连 ...

MHC-I单体的S300 柱层析 在上述生物素化的样品中，折叠为单体的HLA-I类分子相当于样品中S300的组分。经过S300柱层析，可从样品中分离出折叠为单体的HLA-I类分子【试剂及材料】1、 材料（1）层析蠕动泵（Hiload Pump P-50，Pharmacia)（2）紫外监视仪（Monitor UV-1，Pharmacia)（3）部分收集器（RediFrac Fracti ...

MHC-I单体的生物素化分析【试剂及材料】（1）链霉亲和素 0.8mg/ml（2）双蒸水（3）聚丙酰胺凝胶电泳装置及试剂【操作步骤】（1）取2个EP管，分别标上“+”和“-” ，每管加2μg MHC-I单体。（2）用双蒸水将“-”管体积补至10μl（3）在“+”管中加5μl链霉亲和素，用双蒸水将体积补至10μl（4）置室温1小时。（5）每管加10μl 2 X 电泳上样缓冲液不要煮样品，不要加D ...

MHC-I单体的Mono Q柱层析【试剂及材料】1、材料（1）快速蛋白液相色谱装置（FPLC）（2）层析柱（Mono Q HR5/5 Column）（3）离心过滤器（ultrafree-15，ultrafree-4） （4）50ml 聚丙烯离心管（5）IEC GP8R 离心机2、试剂（1）Buffer A ：20mM Tris(PH8.0)（2）Buffer B ：20mM Tris(PH8 ...