PCR技术

目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。申能博彩公司采用的合成仪主要机型为ABI3900高通量合成仪，合成长链主要采用Beckman 1000M和PE8909 DNA合成仪，引物修饰和高OD数合成采用ABI394等。

对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3‘端不要以A结尾，最好是G或者C,T也可以；3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或 CCC,否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在55~70度之间，GC%应该在45%~55%间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5。

寡聚核苷酸引物的选择，通常是整个扩增反应成功的关键。所选的引物序列将决定PCR产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值这个和扩增物产量有关的重要物理参数。好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生，甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模板。引物设计也极大的影响扩增产量：若使用设计粗糙的引物，产物将很少甚至没有；而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。当然，即使有了好的引物，依然需要进行反应条件的优化，比如调整Mg2+浓度，使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。

我们做实验室有时会用到别人已经用过的引物，但如何才能知道这个引物是否正确呢？我通常利用prime 5.0来验证引物。下面我用常用的内参G3PDH将验证过程介绍如下：G3PDH的引物序列来自一片外文文献：上游：AATGCATCCTGCACCACCAA下游：GTAGCCATATTCATTGTCATA 所得片断为516bps.首先在pubmedline中查到G3PDH的mRNA序列，如图 然后 ...

自从1985年美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室 Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应（PCP0 以来，PCR已经成为了分子生物学领域最基本也是最重要的技术手段之一[1]。然而能否找到一对合适的核苷酸片段作为引物，使其有效地扩增模板DNA序列，无疑决定着PCR的成败。现在动物遗传育种早已进入了分子时代，在基因水平寻求影响动物遗传表型的新基因突显重要，因此引物设计无疑又成为了寻找新基因的重中之重。

RT-PCR步骤:一、总RNA提取1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。2. 震荡30s。3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。4. 12000×g，4℃离心，15min。5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。7. 12000×g，4℃离心，10min。在管底部可 ...

对扩增产物进行可重复性的定量长期以来一直是科学家和研究者的目标。传统的方法需要对终产物进行凝胶电泳分析。这种方法可以确定目的产物和竞争产物的大小，估算纯度，计算条带强度。然而，所用扩增试剂和体系的变动会造成扩增的终产物的重复性有较大的变动，成为这种方法的主要弊端。

对扩增产物进行可重复性的定量长期以来一直是科学家和研究者的目标。传统的方法需要对终产物进行凝胶电泳分析。这种方法可以确定目的产物和竞争产物的大小，估算纯度，计算条带强度。然而，所用扩增试剂和体系的变动会造成扩增的终产物的重复性有较大的变动，成为这种方法的主要弊端。

inverse-PCR是克隆插入片段侧翼序列非常有效的方法。通常采用的Tail-PCR假阳性太多，而Inverse-PCR一般只要有特异条带，基本上就是目的片段。

寻找差异表达的基因有不少方法，抑制消减杂交（SSH）是比较有效的一种方法。以Clontech的PCR-Select cDNA Subtraction Kit为例：将样品（tester）和对照（driver）的mRNA分别反转录并合成为双链cDNA后进行酶消化；样品（tester）分为两组，分别加上不同的adaptor1/2；再将两组样品（tester）分别与过量的对照（driver）杂交，两份杂交结果混合，加入过量的对照再进行第二轮杂交；补齐adaptor然后用PCR选择性扩增。

　　PCR 技术现在已成为现代分子生物学实验工作的基础技术和有效工具，在医学、农业、检验检疫等领域中使用十分广泛。其核心设备－PCR仪经过不断改进，已经越来越完善和智能化，分类也更加细化，但厂家一般自行命名型号，技术指标的参数也不统一，给用户的选择带来了困惑和麻烦。 　　总体来说PCR仪可分为普通PCR仪、梯度PCR仪器和实时荧光定量PCR仪等。 　　下面将列出一些PCR仪器生产商/品牌供评比。

原位PCR是Hasse等于1990年建立的技术,就是在组织细胞里进行PCR反应,它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点,是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。

第一链cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类。随机引物法是三种方法中特异性最低的。Oligo（dT）起始比随机引物特异性高。基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。

引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

随着分子生物学研究发展的不断广泛和深入，PCR已成为一门相当成熟的常规技术，而热聚合酶（即Taq酶）的合理选择是PCR成败与否的一个关键因素。目前市面上有多种Taq酶，能够满足多方面的实验需要。那么，如何选择最合适的Taq酶？根据用户经常考虑的指标，如特异性、保真性、耐热性、扩增速率、扩增片段长度、能否进行复杂模板扩增以及优化条件难易等等，我们在这儿将主要的Taq酶归归类，其性质、用途也就一目了然了。

“Real-time PCR”的四个循环阶段

Real-time PCR 仪器使用（动画）

RT-PCR的实验步骤： 取200mg组织，放到1.5ml EP管中，加入1ml Trizol剪碎。震荡30s。加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min……

首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length）、产物长度（product length）、序列Tm值（melting temperature）、ΔG值（internal stability）、引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）、错误引发位点（false priming site）、引物及产物GC 含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。

这是biorad公司为了推出新产品而编写的一首PCR之歌，一群可爱的人把PCR的过程唱的如此深情，好像是P疯的感觉。