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        抑制消减杂交SSH步骤

        互联网

        6971

        一、cDNA第一链的合成

        1、在0.5ml经DEPC处理过的离心管中分别加入tester和driver的mtRNA各2ug,然后加入1ul(10uM) 随机引物(9mer),70℃温浴2min,然后迅速置于冰上放置2min,然后在每管中加入如下混合物:

        5×First-strand Buffer2ul
        dNTPs Mix(10mM)1ul
        sterile H2O1ul
        AMV Reverse Transcriptase(20U/ul)1ul

        2、42℃反应1.5hr,然后将离心管置于冰上,终止cDNA第一链的合成,然后马上进行第二链的合成。

        二、cDNA第二链的合成

        1、在已经合成好cDNA第一链的离心管中加入每管如下反应物,16℃反应2hr:

        sterile H2O 48.4ul
        5×Second-strand Buffer 16.0ul
        dNTPs Mix(10mM)1.6ul
        20×Second-strand Enzyme Cocktail 4.0ul

        2、加入2ul(6U)T4 DNA Polymerase,16℃反应30min。

        3、加入20×EDTA/Glycogen Mix 4ul,以终止反应。

        4、加入100ul 苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提,并沉淀出cDNA双链,溶解于50ul双蒸水中。

        三、cDNA质量检测

        根据一个油菜线粒体基因Ccl1(GI:1694628)的cDNA序列设计特异性引物(CF:5′-TGA CAC GAG ATG ATA AAG A-3′ CR:5′-CGT AAC AAT AGA GCA GGA TAG-3′),目标片段大小为427bp。以反转录所得cDNA为模板,若PCR扩增能得到目标片段,说明线粒体mRNA已经成功反转录。

        四、Rsa I酶切双链cDNA

        1、tester和driver cDNA经37℃过夜酶切,酶切体系为:

        ds cDNA43.5ul
        10×Rsa Restriction Buffer5.0ul
        Rsa I(10U/ul)1.5ul

        2、每管用2.5ul EDTA/Glycogen混合物终止反应。

        3、加入50ul 苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提,并沉淀出酶切后的cDNA双链,溶解于5.5ul双蒸水中。


        五、接头连接

        酶切消化的tester双链cDNA分为两份,一份与Adaptor1连接,另一份与Adaptor2连接,具体步骤如下:

        1、取1ul酶切的tester ds cDNA用5ul ddH2O稀释;

        2、连接反应液(Ligation Master Mix)的制备如下:

        sterile H2O 3ul
        5×Ligation Buffer 2ul
        T4 DNA Ligase 1ul

        3、在两个EP管中分别加入如下试剂:

        component Tester1-1 Tester1-2
        diluted tester cDNA 2ul 2ul
        Adaptor1(10Um) 2ul /
        Adaptor2(10Um) / 2ul
        Ligation master mix 6ul  6ul 
        Final volume 10ul 10ul

        4、在另一离心管中混合1.5ul tester1-1和1.5ul tester1-2,连接反应完成后即为本实验所需要的unsubtracted tester control 1-c;

        5、轻微离心,16℃过夜连接;

        6、加入1ul 20×EDTA/Glycogen Mix,终止反应;72℃温育5min使ligase失活;

        7、取1ul unsubtracted tester control 1-c,用1ml ddH2O稀释,该样品将用来进行PCR检测;

        8、所有样品放入-20℃保存。

        六、第一次杂交

        1、每个杂交反应的体系为:

        component Hybridzation sample 1  Hybridzation sample 2
        Rsa digested driver cDNA  1.5ul 1.5ul
        Tester1-1(ligated adaptor1) 1.5ul /
        Tester1-2(ligated adaptor2) / 1.5ul
        4×Hybridzaion Buffer  1ul 1ul
        Final volume 4ul 4ul

        2、每个反应管中加一滴矿物油覆盖,短暂离心;


        3、98℃ 5min,使DNA充分变性;

        4、68℃ 杂交10小时(杂交时间不少于6小时,也不能超过12小时),完成后立即进行第二次杂交。

        七、第二次杂交

        1、配制第二次杂交混合液

        Driver cDNA 1ul
        4×Hybridzaion Buffer  1ul
        sterile water 2ul

        2、取1ul混合液加一滴矿物油覆盖后于PCR仪上98℃变性1.5min。

        3、将移液器调到15ul,轻轻将枪头伸入Hybridzation sample 2中矿物油与液面交界出,小心将样品吸出,并吸入少许空气;用同样的方法吸入新鲜的变性driver,此时hybridzation sample 2和新鲜变性driver在枪头内由一段气体柱分开,将这一状态的混合物打入装有hybridzation sample 1的离心管中,用枪头混匀,短暂离心。

        4、68℃过夜。

        5、加入200ul的dilution buffer后68℃ 保温7min。

        至此杂交完成,差减杂交完毕后将进行两轮PCR扩增。

        八、两次PCR扩增

        第一次扩增反应体系为:

        10×Taq polymerase Buffer  2ul
        dNTPs(10uM) 0.4ul
        Primer 1(10uM) 1ul
        Taq polymerase(2U/ul) 0.5ul
        ddH2O 14.1ul
        第二次杂交产物 2ul
        终体积 20ul

        第一次扩增程序为:

        step1   75℃ 5min
        step2  94℃ 30sec
        step3  66℃ 30sec
        step4 72℃ 1.5min
        step5  go to step2 34 cycles
        step6  72℃ 5min
        step7 4℃  hold

        产物10倍稀释作为第二次PCR的模板。

        第二次扩增反应体系为:

        10×Taq polymerase Buffer  2ul
        dNTPs(10uM) 0.4ul
        nested primer 1(10uM) 1ul
        nested primer 2(10uM) 1ul
        Taq polymerase(2U/ul) 0.5ul
        ddH2O 13.1ul
        10倍稀释后的第一次PCR产物 2ul
        终体积 20ul

        第二次扩增反应程序为:

        step1 94℃  30sec
        step2  68℃ 30sec
        step3 72℃ 1.5min
        step4  go to step1 17 cycles
        step5 72℃  5min
        step6  4℃  hold

        反应结束后用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

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