• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        反向PCR (inverse-PCR)实验步骤

        互联网

        35444

        inverse-PCR是克隆插入片段侧翼序列非常有效的方法。通常采用的Tail-PCR假阳性太多,而Inverse-PCR一般只要有特异条带,基本上就是目的片段。

        基本步骤如下:

        1、反向PCR(Inverse PCR)原理:反向PCR是克隆T-DNA插入位点侧翼DNA序列非常有效的方法。

        a. 选择合适的限制性内切酶位点。并在T-DNA的边界(左边界、右边界均可)和酶切位点附近设计引物P1、P2;

        b. 回收DNA,T4连接酶连接,使酶切后的DNA片段环化;

        c. 回收连接后的DNA,用引物P1、P2做PCR,就可扩增到两端为T-DNA插入序列,中间为侧翼序列的片段。

        2、限制性内切酶消化:选择合适的限制性内切酶,基因组一定要切成弥散性的条带。在酶切之前,应对基因组DNA定量。

        根据T-DNA的左边界序列选择合适的酶切位点EcoRI,BamHI和HindIII/PstI,并在酶切位点上游附近设计引物Z1,Z2,Z3和Z4,然后用这些内切酶分别消化基因组DNA,酶切体系如下:

        Buffer for EcoR I 2μl
        Genomic DNA 3μl
        EcoR I 0.5μl (10u/μl)
        ddH2O 14.5 μl
        20μl

        37度 过夜,电泳检测酶切效果。

        3、回收DNA

        ① 将酶切产物转到1.5ml离心管中,用ddH2O洗涤干净,并稀释到250μl;

        ② 加入等体积的酚和氯仿(V:V=1:1),涡旋混匀,室温静置1min;

        ③ 最大速度(13, 000 rpm)离心1min;

        ④ 将上清移到另一管中,加入等体积的氯仿,涡旋混匀,室温静置1min;

        ⑤ 最大速度(13, 000 rpm)离心2min;


        ⑥ 将上清移到另一管中,加入2.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇,0.1倍体积的3M 乙酸钠(pH=5.2),轻轻振荡混匀,室温静置5min;

        ⑦ 4℃最大速度(13, 000 rpm)离心10~15min;

        ⑧ 弃上清,尽量除去管壁上的液体;

        ⑨ 加入1ml -20℃预冷的70%乙醇,轻轻颠倒几次。最大速度(13, 000 rpm)离心5min;

        ⑩ 除去乙醇,在超净台上平放,将管壁上的乙醇挥发掉,20~40μl ddH2O溶解。-20℃保存。

        4、连接。体系如下:

        DNA 2μl
        10×buffer 10μl
        T4 ligase  1μl
        ddH2 87μl
          100μl 

        12-14℃   overnight

        连接体系比较大,而DNA含量比较低,不需加入PEG4000,这样可以促进分子内的连接,减少分子间的连接。试验中我们采取蹇文婴等(2002)的方法(12-14℃连接48h)。连接完成后,65℃ 水浴10min灭活。按上述3.抽提回收,溶解于40μl ddH2O中。

        然后就可以用回收的链接片段做PCR了。

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序