PCR技术

免疫PCR（immuno polymerase chain reaction,IM-PCR）是1992年Sano建立的一种检测微量抗原的高灵敏度技术。其本质是一种以PCR扩增一段DNA报告分子代替酶反应来放大抗原抗体结合率的一种改良型ELISA。

免疫PCR（immuno polymerase chain reaction,IM-PCR）是1992年Sano建立的一种检测微量抗原的高灵敏度技术。其本质是一种以PCR扩增一段DNA报告分子代替酶反应来放大抗原抗体结合率的一种改良型ELISA。

免疫PCR（immuno polymerase chain reaction,IM-PCR）是1992年Sano建立的一种检测微量抗原的高灵敏度技术。其本质是一种以PCR扩增一段DNA报告分子代替酶反应来放大抗原抗体结合率的一种改良型ELISA。

免疫PCR（immuno polymerase chain reaction,IM-PCR）是1992年Sano建立的一种检测微量抗原的高灵敏度技术。其本质是一种以PCR扩增一段DNA报告分子代替酶反应来放大抗原抗体结合率的一种改良型ELISA。

本文介绍的是一个通过DNA提取、纯化以及PCR扩增来对大豆中外源性 DNA 序列进行检测的方法。从少量的大豆粉中提取并纯化DNA,利用不同的特异性引物进行PCR反应，再通过电泳结果来决定样品中是否有转基因成分。实验的主要目的是熟悉一些常规技术，如DNA提取与纯化，以及PCR技术的理论和应用。

PCR的假阳性问题深受重视，但PCR假阴性问题相对于临床检测更为严重。涉及了与PCR实验的几乎所有人员和技术环节，十分复杂。

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。寻找污染原因并采用适当的方法检测、防止污染显得尤为重要。

通常所用的PCR方法都在目标产物精确程度和合成片段的大小两个方面有局限。利用两种DNA聚合酶进行较大片段DNA的扩增并使两种类型酶的接近最佳配比即可使反应有效进行。

病原检测方法及仪器是人感染猪流感防控的关键环节。实时荧光定量PCR分子诊断核酸检测技术在以往禽流感检测中被采用为国家标准并广泛使用。最新发布的美国CDC和我国卫生部法规都将实时荧光定量PCR确定为人感染猪流感实验室检测的确诊方法。

DNA聚合酶要进行DNA聚合反应时一定要有引子 （primer），因为它只能以引子所提供的3'-OH为起始点进行延伸 （extension） 的工作，而不能就地重新合成新的DNA （de novo synthesis）。

PCR是极为重要的DNA增殖技术，应用层面非常广，其中包括了核酸探针的制备。如果一段DNA已经被次选殖至载体上，要以PCR扩增这段DNA时，可根据质体multiple cloning sites两边的序列，选用适当的核酸引子 （universal primers） 进行扩增反应；比较常用的引子包括SP6, T3 与T7 promoter primer, M13/pUCforward与reverse primers等；若有特殊考量，也可以使用序列专一性核酸引子对。进行PCR反应时若同时添加 [α-32P]dNTP或DIG-11-dUTP,所增殖的DNA即被32P或DIG所标定，所以PCR是制备核酸探针非常便捷好用的方法。

聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction ,PCR）是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。

根据已知的脊椎动物某一特定基因的氨基酸序列的保守区域设计简并引物，利用RT-PCR技术获得该基因的核心片断，将该片断分离纯化后与T载体连接，转化大肠杆菌，挑取白色菌落，经 PCR反应鉴定得到阳性克隆，送阳性克隆的PCR产物去测序，从而获得目的基因的cDNA核心片断的序列。

聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction ,PCR）是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。

Oligo DNA是以OD260单位来计算的，这是指在1ml体积1cm光程标准比色皿中，260nm波长下吸光度为1A260的Oligo溶液定义为1 OD260单位，根据此定义，1 OD260单位相当于33μg的Oligo DNA,您可以根据此数据和您的Oligo DNA分子量，计算得到摩尔数以计算不同摩尔浓度的溶液。

随机引物 适用于长的或具有发卡结构的RNA.适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。 Oligo dT 适用于具有PolyA尾巴的RNA.（原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也 会使全长cDN ...

随机引物：适用于长的或具有发卡结构的RNA.适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。oligo dT：适用于具有PolyA尾巴的RNA.（原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也 会使全长cDNA合成量大大减少。

引物设计基本原则：1. 引物的长度。一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不能大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度。2.产物的长度……

作为目前最好、最专业的引物设计软件，Oligo的功能很强，在这里我们介绍它的一些主要功能，如：普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估引物对质量等等。

The specific complementary association due to hydrogen bonding of single-stranded nucleic acids is referred to as "annealing": two complementary sequences will form hydrogen bonds between their complementary bases (G to C, and A to T or U) and form a stable double-stranded, anti-parallel "hybrid" molecule. One may make nucleic acid (NA) single-stranded for the purpose of annealing - if it is not single-stranded already, like most RNA viruses - by heating it to a point above the "melting temperat