Random priming

DNA聚合酶要进行DNA聚合反应时一定要有引子 （primer），因为它只能以引子所提供的3'-OH为起始点进行延伸 （extension） 的工作，而不能就地重新合成新的DNA （de novo synthesis）。

一般实验常以人工合成的寡核苷酸为引子进行DNA聚合反应，这时固然可以根据已知序列设计核酸引子，但也可以采用逢机引子（random primers）。

所谓逢机引子即其序列为逢机序列，不经特别设计，目前应用最广者是以自动化机器所合成的、六到八个核苷酸长的寡核苷酸混合物；反应进行中若有任何一条逢机引子结合到模版DNA，即可引导DNA聚合反应的进行。

以random priming方法进行核酸标定，是以逢机引子引导Klenow fragment（large fragment of E. coli DNA polymerase I） 进行DNA聚合反应，并在反应过程中添加 [α-32P]dNTP或DIG-11-dUTP等标定物质。

而为了避免random priming也发生于载体部份的DNA，最好不要直接以质体DNA为模版进行标定反应，而应预先将目标DNA自载体切除出来。

仪器用具：微量离心机；沸水浴及冰浴

药品试剂：

模版DNA （pBlueGus 的BamHI-HindIII DNA 片段，将由助教提供）

0.2 M EDTA, pH 8.0

4 M LiCl

Random priming kit （Roche）：

Hexanucleotide mix （random primer）

dNTP mixture （1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 0.65 mM dTTP, 0.35

mM DIG-11-dUTP, pH 7.5）

Klenow enzyme （2 U/μL）

绝对酒精

70%酒精

TE （10 mM Tris-Cl, pH 8.0; 1 mM EDTA）

方法步骤：

◆ 以下反应条件与步骤主要参照random priming kit 制造厂商所提供的产品说明书。

1） 取100 ng 模版DNA,加入适量去离子水，把体积补足为15 μL.

2） 于沸水中加热10 min.

◆ 请记得以夹子固定微量离心管的管盖部份，以免离心管在加热过程中盖子爆开、进水！

3） 加热后，迅速把微量离心管移至冰浴中，静置数分钟。

4） 离心数秒后，依序加入下列三种试剂：

2 μL hexanucleotide mix

2 μL dNTP mixture

1 μL Klenow enzyme

5） 以指头轻弹离心管，以便混合均匀。

6） 短暂离心后，置于37℃恒温水槽中作用2 h.

◆ 反应时间至少须要1 h,最长可反应过夜。

7） 作用完毕的后，加入2 μL 的0.2 M EDTA,以便终止DNA 聚合反应。

8） 加入2.5 μL 4 M LiCl及75 μL纯酒精，混合均匀，置 -20℃过夜。

隔天：

1） 于13,000 rpm,4℃离心15 min.

2） 倒出上清液，加入50 μL 的70%酒精，再离心5 min.

3） 倒出上清液并风干DNA.

4） 最后以50 μL TE 溶解DNA.