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        PCR实验操作

        互联网

        9633

        PCR是极为重要的DNA增殖技术,应用层面非常广,其中包括了核酸探针的制备。如果一段DNA已经被次选殖至载体上,要以PCR扩增这段DNA时,可根据质体multiple cloning sites两边的序列,选用适当的核酸引子 (universal primers) 进行扩增反应;比较常用的引子包括SP6, T3 与T7 promoter primer, M13/pUCforward与reverse primers等;若有特殊考量,也可以使用序列专一性核酸引子对。进行PCR反应时若同时添加 [α-32P]dNTP或DIG-11-dUTP,所增殖的DNA即被32P或DIG所标定,所以PCR是制备核酸探针非常便捷好用的方法。

        仪器用具:微量离心机;PCR 反应器

        药品试剂:

        模版DNA: pBlueGus 质体DNA (~50 pg)

        核酸引子对: T3 promoter primer 与T7 promoter primer (各2 μM)

        矿物油 (是否需要视PCR反应器机型而定)

        PCR DIG probe synthesis kit (Roche), 内含:

        Taq DNA polymerase (Expand High Fidelity, 3.5 U/μL)

        10×PCR DIG probe synthesis mix (2 mM dATP, dCTP, dGTP, 1.9 mM dTTP,及0.1 mM DIG-11-dUTP, pH 7.0)

        Expand high fidelity buffer with MgCl2 (10×)

        方法步骤:

        以下反应条件主要参照PCR DIG probe synthesis kit 制造厂商所提供的产品说明。

        1) 取一支0.5 mL微量离心管,依下表逐一加入各项试剂 (单位 μL):

        PCR实验操作


        2) 以手指头轻弹管壁使各项试剂混合均匀。

        3) 短暂离心后,徐徐加入100 μL 矿物油。

        ◆ 有些PCR 反应器不需使用矿物油。

        4) 在PCR 反应器上设定PCR 反应条件:Denaturation: 94℃/10 min

        扩增反应:

        30 循环的 [94℃/45 s → 55℃/1 min → 72℃/2 min]

        最后的elongation step:72℃/10 min

        5) 将微量离心管移至反应器上,并开始进行PCR 反应。

        6) 反应完成后,以微量移液器吸出矿物油,并取出5 μL PCR 反应产物,进行洋菜胶体电泳分析。

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