PCR技术

凝胶中PCR产物再扩增标本PCR反应模板的制备 有时DNA模板来源较困难，如病毒核酸或cDNA，一次PCR成功后，要想多获得一些PCR产物，用原模板较浪费，此时可用凝胶中PCR产物作为模板，用低熔点胶回收后溶解直接用于PCR。【操作方法】（1） 用合适浓度（1%）的低熔点胶分离扩增产物；（2） 切下预期的产物，放于微量离心管中，可保存于4℃或立即溶解应用； ...

免疫PCR(IM-PCR) 免疫PCR是将抗原抗体反应的特异性与体外扩增DNA的技术相结合用于检测生物样品中含量极少的蛋白质，如细胞因子，微量抗原等的方法。首先由Sahot等用重组的链霉亲合素和A蛋白的嵌合体，将免疫法和PCR结合在一起而形成。其基本原理和酶联免疫固相检测法(ELISA)一样只是标记物质为一段特定的DNA，并且通过PCR扩增进行检测。为此它要比ELISA敏感10万倍敏感 ...

内参照定量PCR PCR可分析极微量的DNA，并可同时扩增多种序列，已应用于基因转录水平的研究。尽管PCR是一种较理想的核酸定量方法，但实验方案的选择对PCR定量的成功与否极为重要，因为PCR是一个指数过程，控制反应率的任一参数的微小变化都会显著影响产物的生成量，在这些参数被精确优化与控制后，也还可能出现不同反应管中的产物量的差异，而导致结果的偏差。0 设置内参照是理想的定量方法它 ...

直接原位PCR（In situ PCR） 原位PCR是原位杂交细胞定位和PCR的高灵敏度相结合的技术，使得靶基因检测有了极大的改进。此技术是在细胞（爬片、甩片或涂片）或组织（石蜡、冰冻切片）上直接对靶基因片段进行扩增，通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。1． 组织切片和细胞样品的制备【试剂与配置】10%福尔马林二甲苯PBS【操作方法】（1）用10%福尔马林固定组织8 ...

常用的细胞因子引物表细胞因子引物序列产物(bp)IL-1a5’ ATGGCCAAAGTTCGAGACATG3’ CTACGCCTGGTTTTCCAGTATCTGAAAGTCAGT816IL-1b5’ ATGGCAGAAGTACCTAAGCTC3’ TTAGGAAGACACAAATTGCATGGTGAACTCAGT810IL-25’ ATGTACAGGATGCAACTCCTG3’ TC ...

PCR扩增样本DNA的HLA基因片段（一）PCR扩增体系（1） 1.0uM 引物（2） 300ng待测样本基因组DNA（3） 2.0U Taq多聚酶（4） 200uM 各种dNTP（5） 用1 X PCR缓冲液（10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01%明胶）调至总体 ...

PCR-RFLP HLA结果分析参照限制性核酸内切酶酶切位点在HLA等位基因DNA序列上的分布情况，根据样本的PCR-RFLP结果，对样本的HLA基因型别进行判断。由于篇幅限制，仅介绍DR1纯合子亚型的鉴定作为说明。DR1纯合子样本各种等位基因的PCR-RFLP带型DR1等位基因组合限制性核酸内切酶Ava IIPst I0101/0101110102/0102100103/0103010101 ...

PCR扩增产物的RFLP分析（一）PCR产物用各种限制性核酸内切酶酶解将PCR扩增产物分装，并用下列不同的限制性核酸内切酶酶切DR1：Ava II，Pst IDR2：Fok I，Sau 96，HpH IDR3、8、11、12、14：Ava II，Fok I，Kpn I，Hae II，Sau96，SfaN I，Sac II，Apa I（1） 将8ul PCR扩增产物与1ul相应的酶 ...

噬菌体展示抗体库构建目的基因的获得PCR引物的设计 利用PCR技术扩增抗体VH和VL基因所获得的产物需要满足以下两个要求：首先得到的产物必需是正确的目的基因要有可靠性；其次要获得尽可能多种类目的基因即有多样性。因此设计出合理的扩增引物十分重要。 哺乳动物功能性抗体基因是由种系基因在DNA水平上重排产生的。以小鼠的抗体重链为例VH基因由V、D、J三部分构成。在小鼠第12号染色体上大约 ...

差异性甲基化杂交(DMH) 1)微阵列构建 (1)基因组片段化：将雄性个体(雄性个体包括完整的染色体，即含有Y染色体)基因组DNA经MseI消化(MseI识别位点为TTAA，可以保证富含CpG的片段不被破坏)成约200bp的小片段，而CpG岛仍然保持相对完整。 (2)去除富含甲基化CpG的高度重复序列：如上所述，在正常组织或细胞中，5mC多发生在高度重复序列，使得这些重复序列得 ...

甲基化特异性PCR(MSP) 1)MSP原理：MSP是一种简便、特异的、敏感的检测单基因甲基化的方式。其基本原理是用亚硫酸氢钠处理基因组DNA，未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，然后用3对特异性的引物对所测基因的同一核苷酸序列进行扩增。扩增产物用DNA琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描观察分析结果。MSP示意图注：①亚硫酸氢钠处理；QPCR 此原理的关键在于3对特异引物的设 ...

基因组非特异性甲基化水平的研究 1．3H―SAM掺入后液闪检测法 (1)将约2ug基因组与足量3H标记的SAM，甲基化酶(Sss工或HpaⅡ)共同温育，SAM的甲基化基团将被掺人到目的DNA中未甲基化的胞嘧啶上。 (2)以WhatmanDE81滤纸过滤此温育混合物，并以液闪缓冲液淋洗去掉未结合的3H标记的SAM，以液闪检测该滤纸上结合的’H标记的SAM量。如此值较高，则提示原来 ...

PCR反应的五要素 ：引物、酶、dNTP、模板、Mg2+浓度

PCR产物克隆方法:平端连接、粘端连接、T4DNA聚合回切产生粘端、T－vector法、共环消解法、无连接酶亚克隆法(A)。

本文主要介绍了聚合链反应以及聚合链反映的优化条件

Madison, WI USA. (2010年8月10日) Promega新的GoTaq® 2-Step RT-qPCR System（GoTaq®两步法RT-qPCR系统）使得研究者可以检测到低水平表达的目的基因，甚至可以检测难以扩增的样品。两步法系统提高了灵敏度，扩展了RNA定量的动态范围，提供了一个强劲的基因表达分析工具。

实时定量PCR是检测基因表达最灵敏，最可靠的方法。通过在试验过程中，实时监测荧光染料的信号变化，反映样品中的基因拷贝数。实时定量PCR线性范围广（能达到5个数量级），因此可以检测同一样品中表达量极低的基因和表达量很高的基因。但是，由于实时定量PCR需要制备标准曲线和同时分析内参基因，因此，每次实验只能检测少数几个基因的表达水平，若要检测大量基因，则工作量巨大，耗时长久。

一、 材料 　　基因组DNA(大于50kb分别来自不同的材料)。 　　二、设备 　　电泳仪及电泳槽， 照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板(比胶块略大) 4块，吸水纸若干，尼龙膜(依胶大小而定)，滤纸 ，eppendorf管(0.5ml)若干。 　　三、试剂： 　　1、限制性内切酶(BamHⅠ EcoRⅠ HindⅢ XbaⅠ)及10×酶切缓冲液。 　　2、5×TBE电泳缓冲液：配方见第一章 ...

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许多真核生物的基因所包含的DNA,远非单个重组子所能容纳得了的，因此要把克隆扩展成叠连群，而这又需要高库容量且无大缺口的基因组文库。此法能否成功，还取决于对这些大的、非嵌合性的、并且序列未知的基因组5’和3’端的有效鉴别。许多技术已用于简化这一过程及避免克隆载体和克隆DNA之间的连接区，本文着重介绍了其中一种不失为较为简单便宜的单一位点PCR方案操作过程。