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        RFLP实验操作步骤

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        8759
        一、材料

        基因组DNA(大于50 kb,分别来自不同的材料)。

        二、设备

        电泳仪及电泳槽,照相用塑料盆5只,玻璃或塑料板(比胶块略大)4块,吸水纸若干,尼龙膜(依胶大小而定),滤纸,eppendorf管(0.5 ml)若干。

        三、试剂:

        1. 限制性内切酶(BamHⅠ,EcoRⅠ,HindⅢ,XbaⅠ)及10×酶切缓冲液。

        2. 5×TBE电泳缓冲液。

        3. 变性液:0.5 mol/L NaOH,1.5 mol/L NaCl。

        4. 中和液:1 mol/L Tris·Cl,pH7.5/1.5 mol/L NaCl。

        5. 10×SSC。

        6. 其它试剂:0.4 mol/L NaOH,0.2 mol/L Tris·Cl,pH7.5/2×SSC,ddH2O,Agarose0.8%,0.25 mol/L HCl。

        四、操作步骤
        1. 基因组DNA的酶解

        (1)大片断DNA的提取详见基因组DNA提取实验,要求提取的DNA分子量大于50 kb,没有降解。

        (2)在50 μl 反应体系中,进行酶切反应:

        5 μg 基因组DNA
        5 μl 10×酶切缓冲液
        20单位(U)限制酶(任意一种)
        加ddH2O,至50 μl

        (3)轻微振荡,离心,37℃反应过夜。

        (4)取5 μl 反应液,0.8%琼脂糖电泳观察酶切是否彻底,这时不应有大于30 kb 的明显亮带出现。

        2. Southern转移

        (1)酶解的DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳(可18 V 过夜)后EB染色观察。

        (2)将凝胶块浸没于0.25 mol/L HCl中脱嘌呤,10分钟。

        (3)取出胶块,蒸馏水漂洗,转至变性液变性45分钟。经蒸馏水漂洗后转至中和液中和30分钟。

        (4)预先将尼龙膜,滤纸浸入水中,再浸入10×SSC中,将一玻璃板架于盆中铺一层滤纸(桥)然后将胶块反转放置,盖上尼龙膜,上覆二层滤纸,再加盖吸水纸,压上半公斤重物,以10×SSC盐溶液吸印,维持18-24小时。也可用电转移或真空转移。

        (5)取下尼龙膜,0.4 mol/L NaOH30秒,迅速转至0.2mol/LTris·Cl,pH7.5/2×SSC,溶液中,5分钟。

        (6)将膜夹于2层滤纸内,80℃真空干燥2小时。

        (7)探针的制备和杂交见第九章分子杂交部分。

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