PCR技术

Colony PCRDavid AmbergThis procedure will work for both yeast and E. coli:Take a small colony and suspend it in 5ul of H2O in a PCR tube. Heat for 5 min at 95¡C and then spin the condensation down in ...

INTRODUCTION The products of a PCR reaction - especially when this is done on eukaryotic genomic DNA and when using degenerate primers - often contain a mixture of discrete-sized bands one of which is ...

Disruption by Fusion PCRDavid Amberg and Ellen Beasley1) In separate PCR reactions amplify the 5' and 3' ends of the gene of interest with primers about 200 bases apart. Primer 2 should begin with 24 ...

collect piece of tissue (e.g. pieces of a leaf or flower) in Eppendorf tube containing 40 ml 0.25 N NaOH put in boiling H2O for 30 sec (optimum may need to be determined for each type of tissue for fl ...

点击浏览该文件PCR方法相关产品:电泳设备紫外设备普通PCR仪定量PCR仪PCR/RT-PCR/qPCR试剂PCR引物 PCR试剂PCR对照特异性PCR试剂盒PCR克隆试剂盒RNA RNase检测/去除 RT-PCR试剂 RT-PCR标准品 定量PCR试剂 定量PCR标记 总RNA分离纯化盒PCR产物纯化核酸酶 聚合酶 反转录酶 ...

Polymerase Chain Reaction (PCR) to Amplify rRNA Gene FragmentPrepare sufficient master mix for both partners (45 mL/50 mL reaction) 10 mL 10x PCR buffer 10 mL 2.5 mM dNTPs (0.25 mM final concentration ...

（一）、仪器设备 英国Thermo Hybaid原位PCR仪。 （二）、操作流程 1、原位PCR步骤 1）预处理：（1）切片常规脱蜡；（2）0.2mol/L HCl处理10min；（3）5μg/ml蛋白酶K消化组织37℃10min；（4）Nase消化组织37℃ 30min；（5）梯度酒精脱水，室温干燥。2） ...

RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不会出太大问题。 3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有 ...

大批量、廉价、用于测序的PCR产物纯化方法--PEG沉淀 最近，摸索了一下PEG沉淀PCR产物的方法，贴出来，与大家共享。 目的：探索一种方法，能将PCR产物大批量地、廉价地、纯度比较高地纯化出来，并且最好能去掉200bp以下的小片段DNA，用于DNA测序。 有文献和方法说，不同浓度的PEG能沉淀不同长度的DNA，所以，先做了一下不同PEG浓度对DNA沉淀的作用，见下图，标本是用的50bp DNA ...

PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。常见问题如下： 一、假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质 ②模板中含有Taq酶抑制剂 ③模板中蛋白质没 ...

拖尾 　　现象：产物在凝胶上呈Smear状态。　　原因：　　1.模板不纯　　2.Buffer不合适　　3.退火温度偏低　　4.酶量过多　　5.dNTP、Mg2+浓度偏高　　6.循环次数过多　　对策：　　1.纯化模板　　2.更换Buffer　　3.适当提高退火温度　　4.适量用酶　　5.适当降低dNTP和镁离子的浓度　　6.减少循环次数　假阳性　　现象：空白对照出现目的扩增产物　　原因：　　靶序列或 ...

第一链cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类。 随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5'末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引 ...

增加PCR的特异性： 1. prime理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些条件a. 足够长18-24bp以保证特异性.当然不是说越长越好太长的引物同样会降低特异性并且降低产量b. GC% 40%~~~~60% c. 5'端和中间序列要多GC以增加稳定性 d. 避免3'端GC rich 最后3个ｂａｓｅ不要有GC或者最后5个有3个不要是GC e. 避免3'端的互 ...

与许多一次做数百块Southern blots的研究人员一样，我第一次用PCR做基因分型（genotyping）时觉得见效很快，不再需要等几天才能看到结果，不再需要DNA显微图像或者操作紫外线了。随着技术的不断进步，RCR使基因组学和转录组学发生了翻天覆地的变化，甚至随着免疫PCR的普及开始进军蛋白组学。目前有许多以RNA为基础的基因分型技术，有些只是名称不同，简单到只是跑块胶，有些很复杂，需要检 ...

We routinely produce dsRNA by in vitro transcription of a PCR generated DNA template containing the T7 promoter sequence on both ends (I. Primer Designed dsRNA). It is also possible to produce dsRNA u ...

一. 样品的制备1. 设计引物。用Oliga6.0对目的基因进行分析，设定引物，引物长度18-21个碱基，扩增片段以200-300bp最为合适。2. PCR扩增并检测。根据不同的引物挑选适合的退火温度进行PCR扩增。扩增产物用2-2.5%的琼脂糖胶跑水平电泳检测，上样量3-5ul。PCR产物为10ng/nl左右为最佳。3. PCR产物与变性buffer混合。在干净的PCR管底部加入5ulSSCP ...

1. Pull out eight glycerol stock plates from the �80oC freezer and set on bench top to thaw. Be sure to remove the foil seal before leaving the plates to thaw.2. Master mix:Per 100ul RXNFor one 96 ...

Troubleshooting discussion is based on the PCR protocol as described in the table below. All reactions are run for 30 cycles.COMPONENTVOLUMEFINALCONCENTRATION1.autoclaved ultra-filtered water (pH 7.0) ...

For quantifying mRNA we use a competitive RT-PCR protocol with internal standard RNAs. These are added in a defined quantity to the RNA sample prior to the RT reaction. The resulting standard cDNA is ...

Andrea J. GossettandJason D. Lieb1 Department of Biology University of North Carolina at Chapel Hill Chapel Hill NC 27599 USA1Corresponding author (jlieb@bio.unc.edu)INTRODUCTIONKnowledge of the DNA ...