原位聚合酶链式反应（in situ PCR）和原位反转录聚合酶链式反应（in situ RT-PCR）操作规程

互联网2013-09-06

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（一）、仪器设备
    英国 Thermo Hybaid 原位 PCR 仪。

（二）、操作流程
   1 、原位 PCR 步骤
     1 ）预处理：
     （ 1 ）切片常规脱蜡；
      （ 2 ） 0.2mol/L HCl 处理 10min ；
     （ 3 ） 5 μ g/ml 蛋白酶 K 消化组织 37 ℃ 10min ；
     （ 4 ） Nase 消化组织 37 ℃ 30min ；
     （ 5 ）梯度酒精脱水，室温干燥。
      2 ）原位扩增：
     （ 1 ）切片滴加特异性序列引物 30 μ LPCR 扩增反应液，覆盖硅化盖玻片，石蜡油封边；
      （ 2 ） PCR 热循环： 94 ℃， 1min ； 55 ℃， 1min ； 72 ℃， 1.5min ，共 25 ～ 30 个循环， 72 ℃延伸 10min ；
      （ 3 ）氯仿洗去盖玻片， 4 ％多聚甲醛后固定 10min ，梯度酒精脱水，干燥。
      3) 原位杂交：
      （ 1 ）加地高辛标记探针的杂交液， 98 ℃变性 10min ， -20 ℃退火 5min ， 42 ℃杂交过夜。
      （ 2 ）杂交后用 2×SSC 洗涤 10min ， 3 次， 1×SSC 洗涤 10min ， 3 次；
      （ 3 ）缓冲液洗涤 10min ， 3 次；
      （ 4 ）加碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体复合物， 37 ℃， 2h ；
      （ 5 ）缓冲液洗涤 5min ， 3 次；
      （ 6 ） NBT 、 BCIP 暗处显色，镜下控制，终止显色。
     （ 7 ）常规脱水：透明、封固。
     2 、原位 RT-PCR 步骤
    1 ）预处理：
      （ 1 ）蛋白酶 K(0.3mg/mL) 54 ℃消化 20min ，蒸馏水洗；
      （ 2 ） 95 ℃加热 3min ，灭活残存的蛋白酶。
      2 ）原位扩增：
      （ 1 ）在有 RNA 酶抑制剂存在的条件下，用随机六聚物进行逆转录反应；
      （ 2 ）用热启动法进行 PCR 扩增。标本加热至 75 ℃时加上反应液，覆以盖玻片，四周用指甲油密封。然后将温度升至 95 ℃， 2min 。再将热循环仪设定为 95 ℃， 45s ， 55 ℃， 1min 和 75 ℃， 45s ，共 26 次循环；
      （ 3 ）扩增结束后，在 80 ℃烤 15min ～ 30min 。
      3 ）原位杂交：
      （ 1 ）杂交前标本 95 ℃加热 3min ；
      （ 2 ）加上杂交液，湿盒内 50 ℃过夜；杂交液组成： 25 ％硫酸葡聚糖， 2×SSC ， 50 ％甲酰胺， 0.33mg/ml 变性的鲑鱼精子 DNA ，每 0 ． 5mL 杂交液内含生物素标记探针 1ng 。
      （ 3 ）扩增的β - 肌动蛋白和 IL-6 用 DAKO 检测试剂盒 K600( 链霉卵白素，生物素标记的碱性磷酸酶和硝基四氮唑蓝 ) 检测。阳性反应呈紫色。