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        原位聚合酶链式反应(in situ PCR)和原位反转录聚合酶链式反应(in situ RT-PCR)操作规程

        互联网

        2320

         

         (一)、仪器设备
           
        英国 Thermo Hybaid 原位 PCR 仪。

         
          (二)、操作流程
             1 、原位 PCR 步骤
             1 )预处理:
            
         ( 1 )切片常规脱蜡;
             
        2 0.2mol/L HCl 处理 10min
            
         ( 3 5 μ g/ml 蛋白酶 K 消化组织 37 10min
             (
        4 Nase 消化组织 37 30min
            
         ( 5 )梯度酒精脱水,室温干燥。
             
        2 )原位扩增:
            
         ( 1 )切片滴加特异性序列引物 30 μ LPCR 扩增反应液,覆盖硅化盖玻片,石蜡油封边;
             
        2 PCR 热循环: 94 ℃, 1min 55 ℃, 1min 72 ℃, 1.5min ,共 25 30 个循环, 72 ℃延伸 10min
             
        3 )氯仿洗去盖玻片, 4 %多聚甲醛后固定 10min ,梯度酒精脱水,干燥。
             
        3) 原位杂交:
             
        1 )加地高辛标记探针的杂交液, 98 ℃变性 10min -20 ℃退火 5min 42 ℃杂交过夜。
             
        2 )杂交后用 2×SSC 洗涤 10min 3 次, 1×SSC 洗涤 10min 3 次;
             
        3 )缓冲液洗涤 10min 3 次;
             
        4 )加碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体复合物, 37 ℃, 2h
             
        5 )缓冲液洗涤 5min 3 次;
             
        6 NBT BCIP 暗处显色,镜下控制,终止显色。
             (
        7 )常规脱水:透明、封固。
             2 、原位 RT-PCR 步骤
           
        1 )预处理:
             
        1 )蛋白酶 K(0.3mg/mL) 54 ℃消化 20min ,蒸馏水洗;
             
        2 95 ℃加热 3min ,灭活残存的蛋白酶。
             
        2 )原位扩增:
             
        1 )在有 RNA 酶抑制剂存在的条件下,用随机六聚物进行逆转录反应;
             
        2 )用热启动法进行 PCR 扩增。标本加热至 75 ℃时加上反应液,覆以盖玻片,四周用指甲油密封。然后将温度升至 95 ℃, 2min 。再将热循环仪设定为 95 ℃, 45s 55 ℃, 1min 75 ℃, 45s ,共 26 次循环;
             
        3 )扩增结束后,在 80 ℃烤 15min 30min
             
        3 )原位杂交:
             
        1 )杂交前标本 95 ℃加热 3min
             
        2 )加上杂交液,湿盒内 50 ℃过夜; 杂交液组成: 25 %硫酸葡聚糖, 2×SSC 50 %甲酰胺, 0.33mg/ml 变性的鲑鱼精子 DNA 0 5mL 杂交液内含生物素标记探针 1ng
             
        3 )扩增的β - 肌动蛋白和 IL-6 DAKO 检测试剂盒 K600( 链霉卵白素,生物素标记的碱性磷酸酶和硝基四氮唑蓝 ) 检测。阳性反应呈紫色。  

         

        相关RT-PCR产品:

        • 电泳设备
        • 紫外设备
        • 普通PCR仪
        • 定量PCR仪
        • PCR/RT-PCR/qPCR试剂
        • PCR引物
        • PCR试剂
        • PCR对照
        • 特异性PCR试剂盒
        • PCR克隆试剂盒
        • RNA
        • RNase检测/去除
        • RT-PCR试剂
        • RT-PCR标准品
        • 定量PCR试剂
        • 定量PCR标记
        • 总RNA分离纯化盒
        • PCR产物纯化
        • 核酸酶
        • 聚合酶
        • 反转录酶

         

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