PCR技术

结构分子生物学进展梁栋材随着学科的交叉渗透和科学技术的迅速发展，一个极其重要的分支学科——结构分子生物学正在高速发展，并已成为当前分子生物学中的一个重要前沿学科。结构分子生物学是结构生物学中最活跃的研究层次，它是在分子层次上从结构角度特别是从三维结构的角度研究和阐明当前生物学中各个前沿领域的重要学科问题。结构分子生物学是一个包括生物学、物理学、化学和计算数学等多学科交叉的，以结构（特别是三维结构）测定为手段， ...

PCR方法实验步骤和常见问题王秀英 (mary at labome dot com)美国新泽西州普林斯顿合原研究有限责任公司 (Synatom Research)译者王秀英 (mary at labome dot com)美国新泽西州普林斯顿合原研究有限责任公司 (Synatom Research)DOIhttp://dx.doi.org/10.13070/mm.cn.1.187日期更新 : 2014-11-05; 原始版 : 2011-10-18引用实验材料和方法 2011;1:187英文摘要A t ...

PCR产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头；PCR产物纯化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求不高，PCR产物也可不加处理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚 ...

一、 建立一个标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。二、 选择正确的酶不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有 ...

各位园友大家好，我想从蛋鸡的腹脂中提取RNA，进行RT-PCR,以beta-actin为内参，测定蛋鸡腹脂中激素敏感脂肪酶（HSL）和脂蛋白脂酶（LPL)mRNA的丰度.现需要设计几对引物。扩增激素敏感脂肪酶（HSL)基因的引物，扩增脂蛋白脂酶(LPL)基因的引物以及内参beta-actin的引物。beta-actin分别在这两种酶表达中作为内参时它的引物是否也不一样，会因酶而异。我从NCBI上查到这两种酶以及内参在禽 ...

实时荧光定量PCR——一种科学准确的定量方法实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。一. 实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧 ...

PCR常见问题总汇来源：友谊中联生物科技PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多 ...

１．小硕我正在做关于维生素Ｄ３受体（ＶＤＲ）多态性实验，准备用ＢｓｍＩ酶切２．文献上多用Ｍｏｒｒｉｓｏｎ的经典引物：Ｐ１5′CAA　ＣCA　AGA　CTA　CAA　GTA　CCG　CGT　CAG　TGA3′和Ｐ２AAC　CAG　CGG　GAA　GAG　GTC　AAG　GG3３．但是Ｐ２在pubmed上ＢＬＡＳＴ后如下|74268229|gb|BC103387.1| Bos taurus similar to calcium acti... 34.2 4.1gi|77735552|ref|NM_001034300.1| ...

TGFβ1 上、下游引物序列为: 5'-GGACTACTACGCCAAAGAAG-3 ’5’-TCAAAAGACAGCCACTCAGG-3’长度为294 bpTGF-1 - CGTGGAAATCAATGGGATCAGGGCCATGAGGAGCAGGAATGF-1 - forward primer: 5'-ACCTGCAAGACCATCGACATG-3';reverse primer: 5'-CGAGCCTTAGTTTGGACAGGAT-3';TGF-1 sense prime ...

我想做一种蛋白的mRNA水平检测，只想知道mRNA水平量的变化，不继续做表达等了，拜托了2005年5月1日引物1sense:5'TGCCTGGCTGAGCGTTACanti--:3'TTTCCTGGTGTTCAGAGTCG引物2sense:5'TGCCTGGCTGAGCGTTACanti--:3'AGATTGGTGTCGGGTTGT引物3sense:5'AGTGCCTGGCTGAGCGTTACanti--:3'TTT ...

大侠，你好，我是一位涉世不深者，用TAKARA公司的3'RACE试剂盒刚克隆完3'RACE的序列，大概1000bp，现在想同样用5'RACE的试剂盒把5'末端做出来，但是因为TAKARA的试剂盒要设计5条引物，一条反转录引物，两对PCR引物，我觉得有点难，请哪位大侠告诉我设计这几条引物应该注意什么，该如何设计，我把序列也贴出来，希望哪位大侠帮帮忙，有时间帮我分析一下这段序列，当然如果帮我设计这5条引物来，小生真是不甚 ...

pH计使用注意、 一般情况下，仪器在连续使用时，每天要标定一次；一般在24小时内仪器不需再标定。2、使用前要拉下电极上端的橡皮套使其露出上端小孔。3、标定的缓冲溶液一般第一次用pH=6.86的溶液，第二次用接近被测溶液pH值的缓冲液，如被测溶液为酸性时，缓冲液应选pH=4.00；如被测溶液为碱性时则选pH=9.18的缓冲液。4、测量时，电极的引入导线应保持静止，否则会引起测量不稳定。5、电极切忌浸泡在蒸馏水中。6、保持电极球泡 ...

引物设计对于在做PCR实验的同志们来说是必不可少一项。本人从开始做PCR由不会设计引物到会，其中感概颇多。这里就PCR引物设计的几个基本法则谈谈，和大家分享一下。引物设计的基本法则1. 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.引物 ...

PCR引物设计及软件1. 引物设计的原则引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm值 (melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal s ...

PCR 引物设计及软件使用技巧张新宇，朱有康，高燕宁（中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所，北京100021）摘要：本文旨在介绍使用软件设计PCR 引物的技巧。在PCR 引物设计原则的基础上，详细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法，并对其各自的优缺点进行了比较。一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。关键词：PCR；引物设计中图分类号：Q524 文献标识码： 文章编 ...

FlashGel:可在五分钟内测出DNA及片断】DNA电泳实时检测预制胶系统Lonza公司有一款新型的DNA凝胶电泳系统——FlashGel，利用创新性的技术它可以在2～7分钟内分离DNA，并且它还有一个奇妙的功能，可以边跑边看。而且利用FlashGel系统，你可以在电泳的同时看到胶中的每一条带。此系统比传统的凝胶电泳更加精确，无需紫外线就可以观察到DNA条带。FlashGel系统采用的是包装好的预制胶和缓冲液 ...

microRNA(miRNA)是一类有大约22个核苷酸组成的非编码小分子RNA，其广泛存在于真核生物中。miRNA在个体发育的不同时期及不同组织中有不同的表达模式，都表明了其在发育和分化中起有重大的调控作用。迄今为此，对miRNA的检测方法主要有Northern Blot 等基于分子杂交的方法，这些方法敏感度低、耗时长、RNA的用量较大。miRNA qPCR Detection Kit采用了国际上公认的核酸检测标准技术――Real ...

一、RT-PCR1. cDNA产量的很低可能的原因：RNA模板质量低对mRNA浓度估计过高反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足同位素磷32过期反应体积过大，不应超过50μl2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅最常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系与反应起始时RNA的总量及纯度有关建议在试验中加入对照RNundefined第一链的反应产物在进行PCR扩增时，在总的反应体 ...

miRNA实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR从1996年美国Applied Biosystems公司推出实时荧光定量PCR技术以来，该技术已经越来越广泛的应用到各类RNA的研究中，成为研究RNA必不可少的实验手段之一。目前比较常用的方法有两种：（1）TaqMan荧光探针法：该方法在特异性探针的两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，荧光基团发光被淬灭基团吸收；在PCR扩增过程中，探针被降解 ...

因为要做PCR了，但不会设计引物，今天下午在DXY和Pubmed上乱看了一下午，把自己的疑惑写出来，向大家请教。遇到的问题：在引物设计时，找不到需要物种基因的序列，或者想能否设计一个引物，能够在不同物种之间共用（考虑到同源性的存在）。如果能够实现，就一方面可以通过其他物种的信息设计自己需要的引物，另外，也可以合成一个引物在多种细胞动物模型上通用，减少开支。以我下午具体的例子为例：我需要大鼠、小鼠和人的mitofus ...