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        PCR常见问题及回答

        丁香园论坛

        3296

        一、RT-PCR
        1. cDNA产量的很低
        可能的原因:


        2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅
        a. 将第一链的反应温度提高至50℃。
        b. 使用随机六聚体代替Oligo(dT)进行第一链反应。


        3. 产生非特异性条带


        4. 产生弥散(smear)条带


        5. 产生大分子量的弥散条带


        6. 在无反转录酶的情况下,对照RNA获得扩增结果


        7. 扩增产物滞留在加样孔中


        8. SSⅢ与SSⅡ有何不同?
        SuperScriptⅢ反转录酶

        9. 为什么有人更喜欢用SSⅢ而不是ThermoScript?
        ThermoScript如果保存不当会引起活性很快降低,SSⅢ则更稳定。


        10. 为什么使用基因特异性引物(GSP)?
        GSP在扩增低丰度的转录本时是最好的。OligodT引物建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录;随机引物用于mRNA片段的逆转录。


        11. 什么情况下需要使用RNase H?
        在第一轮PCR中RNA/DNA杂合体不能正常变性时


        12. 根据不同的目的选择不同的系统:
        目的 建议
        RT与PCR使用不同的引物
        或需要灵活选择PCR DNA聚合酶 两步法RT-PCR系统
        高灵敏度 一步法或两步法RT-PCR系统
        高特异性 含有适当的DNA聚合酶的两步法RT-PCR系统
        或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系统
        高保真度 含有Pfx Taq酶的两步法RT-PCR系统
        长的反转录结果 通常使用两步法RT-PCR系统可达到最佳结果
        含Elongase酶的一步法RT-PCR系统

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        二、Generacer
        1. 如何针对Generacer试剂盒设计基因特异性引物(GSP)?
        使用5’或3’RACE试剂都需要至少一条基因特异性引物,您在设计引物时需要注意以下几点要求:


        2. 为什么得不到RACE产物?


        3. RACE的PCR结果有杂带
        RACE PCR杂带或非特异性PCR条带可能是由于以下原因:
        注意:杂带一般是因为没有优化PCR条件,可以加入阴性对照来确定。


        4. 得不到全长的5’RACE PCR产物


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        三、PCR

        在进行PCR时:


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        四、引物
        1. 应该选择哪种纯化方法?
        取决于实验目的和引物的长度


        2. 为什么我订购了50nmol,但是收到却只有40nmol?
        50nmol是起始量


        3. 怎样制备100μM的储液?
        体积(μl)=质检报告上的nmol数目×10


        4. 怎样设计引物?


        5. 引物序列有插入或缺失?


        6. PCR无结果?

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