PCR技术

vehemency:1。模板可能有降解，建议避免反复冻融，放置时间不能太长。2。抽提RNA时有污染，包括基因组DNA污染和蛋白质污染，需重做抽提。3。提高退火温度，减少非特异性扩增。4。减少循环次数，减少非特异性扩增。5。电泳缓冲液时间太长，ph值和盐离子浓度明显改变。6。电泳时电压不能太高，8V/cm。7。一般来讲，基于promega和TaKaRa的PCR反应体系中，Mg和dNTP的浓度是相匹配的，不需改动。sstsst ...

PCR常见问题总汇(一）PCR产物的电泳检测时间　　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性 ...

我先后用以下三对引物扩同一片断，退火温度在55-65度，都不出来。第三对引物Lup1我试过加1，1.5,2ulDMSO还是不出。我该怎么办？难道中间的n的个数不正确，n是两个contig之间的gap，这段序列是从ncbi的UCSC库中提取的。先谢过！Lep5:125-779bp=655bpF:Acccacaactccccttctg（19）R:Ccacacttacacaccgcact（20）Lep1:47-738=692b ...

经常看到许多战友因为PCR的非特异扩增而烦恼，不如我们把我们曾经也遇到过这样问题，经过努力后得到了目的条带的成功经验一起分享。首先我先把我的消除非特异扩增的方法先贡献出来，请大家多多批评指正。PCR类型：Long PCR一、PCR体系1、酶：Pyrobest DNA Polymerase2、模板：人类基因组DNA3、引物：根据已知的DNA序列设计的引物。4、目的片段长度：约3.5K（上述四项，我个人认为应当注明，因为许多PCR可 ...

This protocol describes the detailed experimental procedure for real-time RT-PCR using SYBR Green I as mentioned in Xiaowei Wang and Brian Seed (2003) A PCRprimer bank for quantitative gene expression analysis. Nucleic Acids Research31(24): e154; pp.1-8. Please refer to this paper and the P ...

PCR常用优化策略PCR过程中如果没有找到最佳的扩增条件将会导致产生许多不确定的、不需要的产物，有时甚至没有目的产物；而在另一个极端，又可能没有扩增到任何产物。这时改变已知对引物－模板的忠实性和引物延伸有影响的诸多参数中的一两个，将会达到优化扩增的目的。其中最主要的优化变量包括 Mg2＋浓度、缓冲液pH值和循环条件，在循环条件中又以退火温度最为重要。1．降落PCR降落PCR代表了一种完全不同的PCR优化方法，它不是 ...

1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不会出太大问题。3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异 ...

光度计测量的转换:双链DNA (ds DNA)：A260 = OD260 = 1 相当于50 µg/ml溶液单链DNA(ss DNA)：A260 = OD260 = 1相当于33 µg/ml溶液RNA：A260 = OD260 = 1相当于40 µg/ml溶液参考文献：Freifelder, D., Physical Biochemistry: Applications to Biochemistry & Molecular Biology, W.H. Freeman and Company, CA, 1982, p. 494-536.核酸分子量计算方程式：吸光度 ...

确诊丙肝　　目前全世界有近2亿丙肝病毒感染者，我国受感染者就达6000万。由于至今缺乏有效的预防和治疗方法，早期诊断是防止丙型肝炎病毒传播的有效手段。1993年，我国研制成了第一代丙肝检测试剂，但经过多年临床应用，时有漏检现象发生，2003年，科研人员利用新的思路和技术攻克了困扰医疗界多年的问题，研制成了我国自主知识产权的丙肝确认试剂，使广大受血者免受丙肝病毒感染。　　1988年春，一场空前的甲肝大流行突然袭击了中国上海， ...

8月1－10号无人应助贴汇总，请高手出手应助，恳请斑竹从优加分。同时请发贴不规范的战友按照版规修改帖子。求助！ rabbit beta-acitn primer300bp左右http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=4003101&sty=1&tpg=34&age=0请大侠帮我看看我的引物！http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=4003655&sty=1&tpg= ...

近段时间在“PCR技术讨论板”有不少关于RT-PCR引物设计的求助，所求助的引物有相当部分都是用于检测某一基因的表达的。其实，对于很多基因而言，用于检测其表达的RT-PCR引物已早有文献报道，我们完全可以利用这些已有的资源。我们所需要做的只是找到这些已发表的引物序列，通过Blast验证其是否正确、确定其特异性，用软件分析引物的好坏后直接使用就可以了。下面介绍2种搜索引物序列的方法，希望对大家有用。1. 通过搜索基因来 ...

Book Description:The BIOS Advanced Methods series is intended for advanced undergraduates, graduate students and established research scientists. Titles in this series are designed to cover current important areas of research in life sciences, and include both theoretical bac ...

PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增 。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过 放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析 。无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。所谓的实时荧光 ...

实时荧光定量PCR——一种科学准确的定量方法实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。一. 实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧 ...

常规PCR一般注意点：1）PCR模板是关键，引物可以优化。制备模板的时候，一定要注意核酸模板的纯度和量。纯度上要避免杂质和杂蛋白质的混入，同时还要注意添加模板的量，模板很理想的话，不用加太多，加的多了，混进去的杂质机会就多了。当模板的浓度过低,比如低于100个分子时, 引物和模板之间就很难发生反应. 引物容易自身进行反应形成二聚体.用 booster PCR,即开始几个cycles保持primer的低浓度,保证primer:tem ...

PCR 引物设计及软件使用技巧！自从1985 年Karny Mullis 发明了聚合酶链式反应以来，PCR 技术已成为分子生物学研究中使用最多、最广泛的手段之一，而引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物 ...

http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=4280976&sty=1&tpg=44&age=0如何用DGGE-PCR研究微生物分子生态http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=4283300&sty=1&tpg=44&age=0求助：如何设计这种引物呀？？http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=4284441&sty=1&t ...

一、RT-PCR1. cDNA产量的很低可能的原因：RNA模板质量低对mRNA浓度估计过高反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足同位素磷32过期 反应体积过大，不应超过50μl2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅最常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系与反应起始时RNA的总量及纯度有关建议在试验中加入对照RNundefined第一链的反应产物在进行PCR扩增时，在总的反应体系 ...

做了快一年的SYBR G的定量实验了,有一些心得,写出来大家交流下.也是今天在学校的BBS上有人推荐这里的,觉得很不错.我们用的机器是ABI 7900,我自己比较喜欢的试剂是ABgene的QPCR sybr ROX MIX.undefined试剂我一般再进行稀释一倍后使用,反应总体系是10ul.用SYBR G来做的话,引物非常重要.我设计引物使用Primer 5,一般选择上游引物跨最后和最后第二个外显子,下游引物在最后一个外显子中,实在找不到,可以前移, ...

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