DNA实验技术

相关专题 大肠杆菌的基因工程 O是指O抗原，也就是体细胞抗原，是包埋在细菌细胞壁中的脂多糖类;H是指H抗原，也就是鞭毛抗原，是蛋白质类，具有免疫性的结构。除此之外，还有K抗原，也就荚膜抗原，大部分是多糖;以及M抗原，类粘蛋白，多糖类。 大肠杆菌根据这四种不同抗原类型来进行血清学上的分类和分析。 ...

相关专题 大肠杆菌的基因工程 大肠埃希氏菌(E.coli)通常称为大肠杆菌，是人类和大多数温血动物肠道中的正常茵群。但也有某些血清型的大肠杆菌可引起不同症状的腹泻，根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5类：致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(E.I"IEC)、肠黏附性大 ...

相关专题 大肠杆菌的基因工程 ⑴、细胞的生长状态和密度 最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已 经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为0.5时，细 ...

相关专题 大肠杆菌的基因工程 操纵子学说： 1961年，法国科学家莫诺(J·L·Monod，1910-1976)与雅可布(F·Jacob)发表“蛋白质合成中的遗传调节机制”一文，提出操纵子学说，开创了基因调控的研究。四年后的1965年，莫诺与雅可布即荣获诺贝尔生理学与医学奖。 莫诺与雅可布最初发现的是大肠杆菌的乳糖操纵子。这是一个十分巧妙的自 ...

相关专题 大肠杆菌的基因工程 1、获取目的基因。用限制性核酸内切酶切割下目的基因。 2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体(大多数选用质粒)用DNA连接酶连接起来。 3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重组质粒导入农杆菌(农杆菌为受体细胞)。 4、目的基因的检测与鉴定。用DNA分子杂交技术/分子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学水平 ...

相关专题 大肠杆菌的基因工程 大肠杆菌细胞表面没有结合DNA的特异性受体存在，金属离子诱导大肠杆菌摄取外源DNA具有一定的特异性。高浓度非生理条件下Ca2+诱导大肠杆菌摄取外源DNA，可能一方面是高浓度的Ca2+聚集在细胞表面改变了细胞壁的渗透性，使转化DNA更容易接近细胞膜。另一方面少量Ca2+进入细胞与胞内的PHB和Pi结合成复合物，在细 ...

相关专题 大肠杆菌的基因工程 Xl1-Blue菌株 基因型：endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F‘ hsdR17(rK- mK+)。 特点：具有卡那抗性、四环素抗性和氯霉素抗性。 用途：分子克隆和质粒提取。 DH5α菌株 基因型：F- endA1 glnV44 thi- ...

相关专题 大肠杆菌的基因工程 转化 A.将-70 0C下保存的感受态细胞(200μl)，室温下解冻后放置于冰上。 B.将ND-PUCm-T质粒DNA溶液(不超过50ng)或PCR产物与pUCm-T质粒的连结产物，体积不超过10μl，轻轻摇匀，冰上放置30min。 C.42 0C水浴中热击90s或370C水浴中热击5min，热击后迅 ...

相关专题 大肠杆菌的基因工程 冰浴过程中，原来加在溶液中的钙离子和细菌细胞膜结合，在低温下形成液晶结构，这样，在42度热激下，这种液晶结构收缩，将细胞膜扯开孔道，使DNA进入细菌细胞中。这就是原理。 前面冰浴不清楚，热激我认为是让已经有孔的大肠杆菌孔膨胀，增加DNA进入的几率，然后立刻冰浴，使孔收缩，进去的DNA不要出来。个人想法，没看到过类 ...

相关专题 大肠杆菌的基因工程 有几个地方需要检查： 1、菌液是否足够，如果是转化的菌，质粒浓度是否足够，感受态是否制备无误。 2. 涂布器是不是烧过之后直接接触了菌液。 3.平板的抗性是否有误 你可以用一个确定能够转化进细胞并且带有抗性的质粒去和你想转化的质粒做平行试验。 ...

相关专题 大肠杆菌的基因工程 实验室的一般大肠杆菌拥有4288条基因，每条基因的长度约为950bp基因间的平均间隔为118bp(基因Ⅷ)。E.coli基因组中还包含有许多插入序列，如λ-噬菌体片段和一些其他特殊组份的片段，这些插入的片段都是由基因的水平转移和基因重组而形成的，由此表明了基因组具有它的可塑造性。 利用大肠杆菌基因组 ...

相关专题 大肠杆菌的基因工程 通过大肠杆菌表达目的基因大量获得重组蛋白是一个方便快捷的方法。植物中克隆的目的基因被克隆到特异设计的质粒载体上，受噬菌体T7强启动子控制;表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。当需要表达蛋白时，在细菌培养基中加入IPTG来启动表达。不同载体在邻近克隆位点处具有编码不同的多肽“标签”的序列，在定位、检测或纯化 ...

相关专题 大肠杆菌的基因工程 实验步骤： 1、Inoculate from an overnight grown in LB.从培养过夜的LB平板上挑取单菌落 。 2、Grow in 250 ml "SOB" at 18℃ until OD600 = 0.6.(0.3)接种于250ml SOB，18度培养至OD=0.6。 3、On ice f ...

相关专题 大肠杆菌的基因工程 大肠杆菌染色体基因组是研究最清楚的基因组。估计大肠杆菌基因组含有3500个基因，已被定位的有900个左右。在这900个基因中，有260个基因已查明具有操纵子结构，定位于75个操纵子中。在已知的基因中8%的序列具有调控作用。大肠杆菌染色体基因组中已知的基因多是编码一些酶类的基因，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、脂肪酸和维生素 ...

相关专题 一般就是大肠杆菌做为基因工程菌 优点： (1)研究得最为详尽的原核细菌 (2)成熟的基因克隆表达受体细胞 (3)繁殖迅速，培养代谢易于控制 缺点： (1)某些真核生物基因仅能合成出无特异之间结构的多肽链 (2)缺乏蛋白质加工系统 (3)内源性蛋白酶易降解外源蛋白 (4)内毒素导致人体热源反应一般就是大肠杆菌做为基因工程菌 ...

相关专题 大肠杆菌(E.coli)作为分子生物学中最重要的研究工具，具有生长速度快，基因结构相对简单，各种基因操作手段成熟等其他生物不可比拟的优势。大肠杆菌是最传统的模式生物之一，大部分基因工程操作都选择大肠杆菌作为宿主。为了使大肠杆菌的功能、性状满足不同科研工作者的需求，大肠杆菌基因组改造技术应运而生，其主要有以下几种方式： 1) 突变基 ...

相关专题 大肠杆菌的基因工程 在众多模式生物中，最好用且最常用的生物有以下八种。首先是肠道细菌中的大肠杆菌，大肠杆菌在我们身体的大肠内和肛门附近是很常见的细菌，也常常经由尿道逆行而上进行感染，最严重时，连肾脏都会受到伤害;它是细菌中被研究得较清楚的生物，也是分子生物学的必修细菌。其次是面包酵母和啤酒酵母，它们是单细胞真核生物，分别在制造面包和 ...

相关专题 解读miRNA （MicroRNA） 1.RNAi ：(RNA interference)RNA干扰 一些小的双链RNA可以高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰(RNA interference，RNAi ，也译作RNA干预或者干涉)。它也是体内抵御外在感染的一种重要保 ...

相关专题 解读miRNA （MicroRNA） RNA一度被认为仅仅是DNA和蛋白质之间的“过渡”，但越来越多的证据清楚的表明，RNA在生命的进程中扮演的角色远比我们早前设想的更为重要。RNA 干扰(RNA interference)的发现使得人们对RNA调控基因表达的功能有了全新的认识，更因为可以简化/替代基因敲除而成为研究基因功能的有力工 ...

相关专题 解读miRNA （MicroRNA） 尽管真核细胞用RNA干涉抵御转座子和病原体，它们也利用这个方法来调节自身基因的表达。最近的一篇文章发现了RNA干涉在控制内源基因表达的新例子，揭示了一个新的负调节机制。生物信息学分析表明，在脊椎动物中RNA干涉的目标基因可能有数千个。 微小RNA(MicroRNAs;miRNAs) 短干涉RN ...