材料与仪器
器材：高速离心机，涡旋振荡器
试剂：Solution undefined30 mL，Solution undefined120 mL，Solution undefined12 mL，
耗材：Exosome Extraction Columundefined5 Tubes，ExosomePurification Filteundefined10 Tubes
步骤
一、 样品预处理
1、 取样：如果是冻存样品，从冰箱取出后置于 4℃ 解冻，融化后置于冰上；如果是新鲜样品，收集样品后直接置于冰上；
2、 样品处理量（单个柱子处理量）：
注：每个「Exosome Extraction Column」处理量 10~20 mL（未经浓缩的原始上清），样品过少可能导致获得的外泌体浓度低，样品过多可能导致堵柱。
3、 离心去细胞：样品于 4℃ 以 300 ×g（~1,640 rpundefined）离心 5 min，去除样品中的细胞；
4、 离心去细胞碎片：将去除细胞后的样品于 4℃ 以 3,000 ×g（~5,200 rpundefined）离心 10 min，去除样品中的细胞碎片（注：若沉淀较多，可 3,000 ×g，10 min 离心多次至无明显沉淀，每次取离心上清液）；
5、 离心去杂质碎片：将离心上清液转移至新的离心管中，于 4℃ 以 10,000 ×g（~9,500rpundefined）离心 10 min，去除样品中的杂质碎片；
6、 上清液过滤：去除细胞碎片的离心上清液用 0.45 μm 或 0.22 μm 过滤器过滤至新的容器中。
二、 提取前准备
1、 固定外泌体提取柱（Exosome Extraction Column）：取出提取柱，将提取柱上下筛板取下后垂直固定于试管架或铁架台上，待填料保存液自然流尽；
2、 加入 Solution A 溶液：填料保存液流尽后沿柱子内壁缓慢加入 5 mL Solution A 溶液，待 Solution A 溶液自然流尽；
3、 加入 Solution B 溶液：Solution A 流尽后沿柱子内壁缓慢加入 5 mL Solution B 溶液，待 Solution B 溶液自然流尽，等待上样。
三、 提取外泌体
1、 过柱：将经 0.45 μm 或 0.22 μm 过滤器过滤后的细胞上清液沿柱子内壁缓慢多次加入提取柱中，待细胞上清液自然流尽（注：每个「Exosome Extraction Column」上样量 10~20 mL（未经浓缩的原始上清），样品过少可能导致获得的外泌体浓度低，样品过多可能导致堵柱）；
2、 平衡：细胞上清液流尽后沿柱子内壁缓慢多次加入 15 mL Solution B 溶液，待 Solution B 溶液自然流尽；
3、 洗杂：Solution B 溶液流尽后沿柱子内壁缓慢加入 0.8 mL Solution C 溶液，待 Solution C 溶液自然流尽；
4、 洗脱：待上步骤中 Solution C 溶液流尽后沿柱子内壁再次缓慢加入 1 mL Solution C 溶液，收集该流穿液（该流穿液中富含外泌体颗粒）；
5、 浓缩（选做）：若外泌体浓度过低，可用 100 KD 超滤柱将流穿液适当浓缩；
6、 纯化外泌体：将收获的外泌体颗粒粗品转入 Exosome Purification Filter（EPF 柱）上室中，于 4℃ 以 3,000 ×g（~6,200 rpundefined）离心 10 min，离心后收集 EPF 柱管底的液体，此液体即为纯化后的外泌体（注：EPF 柱不可重复使用）；为约 7 cm 有效离心半径的小离心机换算（≤2 mL 离心管）。
7、 外泌体的保存：纯化后的外泌体以合适体积进行分装冻存于-80℃ 低温冰箱中，以备后续实验使用。
来源：丁香实验
