使用水溶性外泌体荧光标记染料染外泌体流程（Aco-600，红色）

一、 染料工作液制备

1、 取染料管，加入 25 μL 水性缓冲液（推荐使用 PBS 或 Opti-MEM 溶解），配置成浓度为 25 μM 的储存液；

2、 使用涡旋振荡器充分振荡 1 min 至染料完全溶解；

3、 40°C 水浴 15 min（如有超声设备，可同步开启超声辅助溶解）；

4、 取洁净 EP 管，对储存液进行分装；

5、 取适量储存液，用缓冲液稀释至 10 μM 的工作浓度。

 

二、 外泌体染色

1、 将 纯 化 的 细 胞 外 囊 泡 (EVs) 浓 度 调 整 至 1011 Particles/mL；

2、 按表 1 构建染色孵育体系：

3、 加入染料工作液后，盖紧离心管盖，用枪头轻柔吹吸混匀，放置于 37℃ 环境，避光孵育 2 小时。

 

三、 去除游离染料

1、 染色完成后，在样品中加入 2 倍体积的 PBS，使用 100KDa 超滤管，以 3000×g 的离心力离心 5 ~10 min，进行超滤置换，去除溶液中游离的染料，将上室样品浓缩至原体积；

2、 重复上述超滤置换步骤 2 次；（完成本次实验后，请丢弃超滤管，切勿留作下次实验重复使用。）

3、 收集超滤管上室的样本，即为染色后的外泌体；

4、 染色后的外泌体建议尽快使用，若在 2 周内使用，可置于 4℃ 环境中避光保存；如需长期保存，可置于-80℃ 冷冻保存，保存时间过长可能影响下游实验效果。

 

四、 细胞摄取

1、 提前 24 小时铺种目标细胞；

2、 用不含外泌体的细胞培养基将染色样本稀释 5~10 倍，使染色 EV 浓度调整为约 5E+09 Particles/mL（超滤后外泌体得率约为 20%）；

3、 吸除待处理细胞原有的培养基；

4、 加入含染色 EV 的新鲜培养基，在细胞培养箱避光孵育 24 小时；

5、 孵育 24 小时后，弃去含有染料的孵育液，用 PBS 清洗细胞 3 次；

6、 根据实验需求选择成像观察方式，可直接进行活体成像，也可固定细胞后成像观察；

7、 若选择固定细胞后成像，使用细胞固定剂在室温下固定 15 min（固定后观察细胞形态是否发生变化，部分固定液渗透压不稳定，可能导致细胞变形）；

8、 弃去固定剂，用 PBS 清洗细胞 3 次，每次 5 min；

9、 使用含 DAPI 的封片剂进行封片（或先用 DAPI 进行核染 10 min，PBS 清洗 3 次，每次 5 min，之后进行封片）；

10、共聚焦成像：Aco-600 的荧光信号收集可以使用 488、514、543、559 或 561nm 的激光器，发射波长从 600 nm 开始收集，常用的通道名称是 RFP；

11、在成像时顺序扫描，避免同时扫描。先收集 Aco-600 的荧光信号，再收集 DAPI 信号（DAPI 的激发器也会激发 Aco-600）。