树突状细胞（DC）细胞培养操作流程

完全培养基的制备

本文概述两步法，在 8 天内进行 3 次补料。第 0 天和第 3 天的前两次补料需要使用分化培养基，而第 6 天的第三次补料需要使用完全培养基，其细节概述如下。~K~Hspan~M~Kem~M~Kspan~M注意：请在每次补料的当天制作新鲜的相应培养基。

1. 制备分化培养基时，在锥形管中加入适量的 PRIME-XV Dendritic Cell Maturation CDM，并补充 GM-CSF（400 IU/ml）和 IL-4（1000 IU/ml）。充分混合，使用前预热至 37℃。
2. 制备成熟培养基时，在锥形管中加入适量的 PRIME-XV Dendritic Cell Maturation CDM，并补充 GM-CSF（400 IU/mL）、IL-4（1000 IU/mL）、TNF-α（500 IU/mL）、IL-6（1000 IU/mL）、IL-1β（1700 IU/mL）和 PGE₂（1 μg/mL）。充分混合，使用前预热至 37℃。

注：列出的浓度是细胞接种后各细胞因子的最终浓度。制备方法可能根据终端应用的培养基换液策略而有所不同。

图：完全培养基的制备流程

细胞制备和接种

以下是基于阴选富集的冷冻单核细胞的方法指南。根据组织来源和用户的偏好和需要，也可以利用各细胞供应商提供的具体方案。

1. 在 37°C 水浴中预热适量的 PRIME-XV Dendritic Cell Maturation CDM。
2. 在 15 mL 的锥形管中加入 9 mL 预热的培养基。
3. 小心地从液氮中取出单核细胞冻存管，并在 37°C 水浴中解冻，直到内容物几乎完全解冻，只剩下少量的冰。
4. 小心地将细胞内容物转移至含有预热培养基的 15 mL 锥形瓶中。
5. 将细胞以 200xg 离心 5 分钟，然后将细胞沉淀重悬于 5 mL 分化培养基中，进行细胞计数。
6. 以约 4.7x10⁵cells/cm² 的活细胞密度接种，添加分化培养基使孔板/培养瓶的最终体积达到所需水平。所需细胞密度和培养体积请参考下表的培养容器类型。

表：培养容器类型以及接种细胞数

1. 将细胞置于 37°C、5%CO₂的加湿培养箱中，并按下文所述进行必要的培养基换液。

培养基换液和成熟诱导

以下为标准方案，可以根据偏好和应用进行修改和调整。

1. 在培养的第 3 天，预热适量的新鲜制备的分化培养基，并进行一半的培养基换液。

注意：对于较大的培养容器，如培养瓶，可能需要收集并离心已使用培养基（200xg，5 分钟），然后将细胞沉淀重悬于适量的新鲜制备的分化培养基中，以防任何可能存在的非贴壁细胞被去除。

1. 将细胞在 37°C，5% CO₂的加湿培养箱中培养 3 天，以完成单核细胞的分化。
2. 在培养的第 6 天，预热适量的新制备的成熟培养基，并进行一半的培养基换液。

注意：对于较大的培养容器，如培养瓶，可能需要收集并离心已使用培养基（200xg，5 分钟），然后将细胞沉淀重悬于适量的新鲜制备的成熟培养基中，以防任何可能存在的非贴壁细胞被去除。

1. 将细胞在 37°C，5% CO₂的加湿培养箱中培养 2 天，以完成树突状细胞的成熟。