NK 细胞培养操作流程（PBMC 来源的 NK 细胞的扩增方案）

活化和扩增培养基的制备

1. 通过添加以下推荐浓度的细胞因子：500 IU/mL 的重组人 IL-2 (rhIL-2)、10 ng/mL 的 rhIL-12、10 ng/mL 的 rhIL-18 和 10 ng/mL 的 rhIL-21，为每 1x10⁶ 个富集的 NK 细胞制备 1 mL 的接种培养基（PRIME-XV NK Cell CDM）。

2. 通过将步骤 1 中细胞因子的相对浓度翻倍，为每 1x10⁶ 个富集的 NK 细胞制备 50 mL 的 2x 扩增培养基（PRIME-XV NK Cell CDM），具体浓度如下：1000 IU/mL 的重组人 IL-2 (rhIL-2)、20 ng/mL 的 rhIL-12、20ng/mL 的 rhIL-18、20 ng/mL 的 rhIL-21。

NK 细胞的准备

3. 使用前，将足够量的 PRIME-XV NK Cell CDM 在 37˚C 预热至少 15 分钟。

注意：为避免多次加热降温，请在预热前确定所需的总体积。

4. 冻存的细胞：在 37℃ 的水浴中轻轻搅拌 1 分钟使细胞解冻。

• a. 小心地将冻存管全部内容物转移到 15 mL 的锥形管中，其中预先加入 10 mL PRIME-XV NK Cell CDM。
• b. 取样计算细胞数。将细胞以 300 g 离心 5 分钟。
• c. 小心吸去上清液，留下最小体积的培养基覆盖细胞沉淀。

5. 新鲜细胞： 小心地将全部内容物转移到 15 mL 锥形管中，其中含有 10 mL PRIME-XV NK Cell CDM。

• a. 取样计算细胞数。将细胞以 300 g 离心 5 分钟。
• b. 小心吸去上清液，留下最小体积的培养基覆盖细胞沉淀。

6. 如果使用完整的 PBMCs，使用磁珠或者使用流式细胞仪富集 NK 细胞。

• a. 阳性分选：富集 CD56⁺ 细胞。
• b. 阴性分选：去除 CD3⁺ 细胞。
• c. 可按需采用多种富集方法。
• d. 取样计算细胞数。将细胞以 300 g 离心 5 分钟。
• e. 小心吸去上清液，留下最小体积的培养基覆盖细胞沉淀。

7. 使用流式细胞术检测细胞表型（是否存活、CD3、CD56、CD16）。

• a. 如果富集 NK 细胞，请对比富集前后的样本。

NK 细胞培养设置

8. 以 0.5 x 10⁶ NK cells/mL 的密度在 1x 的接种培养基（步骤 1）中重悬细胞沉淀。

9. 根据具体应用正确活化细胞。FISI 的研发团队使用的是市售的活化磁珠。

10. 以 2 mL 的体积将活化的细胞和细胞因子混合物分装于 T-25 培养瓶内，在正常组织培养条件下垂直培养。

• a.37˚C 、5% CO₂、加湿环境的培养箱。
• b. 最多培养 14 天。

11. 每隔 2～3 天补充 2x 的扩增培养基（步骤 2）使培养体积加倍。

• a. 可以将细胞转移到更大工作体积的容器中，以适应两周内培养体积的增加。
• b. 每次补充培养基时，评估活细胞密度、细胞活率和流式细胞术表型。
• c. 不需要在两次补充培养基操作期间对细胞进行离心处理。

NKT 细胞的准备

1. 使用前，将足够量的 PRIME-XV NK Cell CDM 在 37˚C 预热至少 15 分钟。

注意：为避免多次加热降温，请在预热前确定所需的总体积。

1. 冻存的细胞：在 37℃ 的水浴中轻轻搅拌 1 分钟使细胞解冻。

• 小心地将冻存管全部内容物转移到 15 mL 的锥形管中，其中预先加入 10 mL PRIME-XV NK Cell CDM。
• 取样计算细胞数。将细胞以 300 g 离心 5 分钟。
• 小心吸去上清液，留下最小体积的培养基覆盖细胞沉淀。

   3. 新鲜细胞： 小心地将全部内容物转移到 15 mL 锥形管中，其中含有 10 mL PRIME-XV NK Cell CDM。

• 取样计算细胞数。将细胞以 300 g 离心 5 分钟。
• 小心吸去上清液，留下最小体积的培养基覆盖细胞沉淀。

   4. 可选：如果使用完整的 PBMCs，使用磁珠或者使用流式细胞仪富集 NKT 细胞。

• 分选 CD3⁺CD56⁺ 细胞。
• 可按需采用多种富集方法。
• 取样计算细胞数。将细胞以 300 g 离心 5 分钟。
• 小心吸去上清液，留下最小体积的培养基覆盖细胞沉淀。

1. 使用流式细胞术检测细胞表型（是否存活、CD3、CD56、CD16）。如果富集 NKT 细胞，请对比富集前后的样本。

NKT 细胞培养设置

1. 补充 1000 IU/mL IL-2 至适当体积的 PRIME-XV NK Cell CDM 中。
2. 将 NKT 细胞沉淀重悬于已补充的 PRIME-XV NK Cell CDM 中，浓度为 0.5x10⁶NKT cell/mL。
3. 以 2 mL 的体积将细胞和细胞因子混合物分装于 T-25 培养瓶内，在正常组织培养条件下垂直培养。

• 37˚C 、5% CO₂、加湿环境的培养箱。
• 最多培养 14 天。

1. 每隔 2～3 天补充 2x 的扩增培养基（步骤 6）使培养体积加倍。

• 可以将细胞转移到更大工作体积的容器中，以适应两周内培养体积的增加。
• 每次补充培养基时，评估活细胞密度、细胞活率和流式细胞术表型。
• 不需要在两次补充培养基操作期间对细胞进行离心处理。