间充质干细胞（MSC）细胞培养操作流程（在 2D 培养容器中扩增 MSC 的方案）

以下方案经过优化，可用于在 2D 培养容器中扩增来自脂肪、骨髓和脐带的人类间充质干细胞（hMSCs）。

包被程序

注意：要在 PRIME-XV MSC Expansion XSFM 中培养 MSCs，组织培养板或培养瓶必须预先涂上细胞附着基质。强烈建议使用 Cellnest（FISI，货号1063967）涂覆培养表面以保持一致性。也可使用其他类型的基质（PRIME-XV 人类纤连蛋白，FISI 货号 31002），基质蛋白的类型和数量取决于每位研究人员的实验设计。

1. 配制 0.5% Cellnest 溶液。将 5 mL 无菌水轻轻加入瓶中冻干的 Cellnest (FISI，货号 1063967)，使浓度为 5 mg/mL。
2. 重新盖上小瓶盖子，将 0.5% Cellnest 溶液在 37°C 下孵育 10 分钟，使 Cellnest 完全溶解。
3. 0.5% Cellnest 溶液通过 0.22 μm 再生纤维素或 PES 过滤膜过滤以确保无菌，并将过滤后的溶液放入新的无菌 15 ml 离心管中。请使用小直径过滤器（13 mm），以尽量减少过滤过程中的体积损失（例如 Nalgene, 货号 7 20-1320）。0.5% Cellnest  溶液可在 2-8°C 下保存 6 个月或在 -20°C 下保存 12 个月。
4. 将 0.5% 的原液在 PBS(FISI，货号 9236）中稀释至最终浓度为 20μg/cm²。请参考下表了解各培养容器的使用参数。

表：不同培养容器的使用参数

1. 将稀释后的涂层溶液加入所需的培养容器中。
2. 按下列条件之一孵育。

如果在 2-8°C 下过夜，培养容器必须用 Parafilm® 密封，以避免变干。建议在使用当天或使用前一天对培养容器包被。

• 37±2℃ 下 1 小时
• 在 15-30°C 下放置 3 小时
• 2-8°C 过夜

1. 在加入细胞之前，从培养容器中抽吸并丢弃 Cellnest 溶液。

冷冻保存的人 MSCs 的复苏

1. 按照包被方案，用 PBS 稀释的 Cellnest 预包被组织培养容器，最终浓度 20 μg/cm²。
2. 预热 PRIME-XV MSC Expansion XSFM 至 37°C。
3. 在 37°C 水浴中迅速解冻冻存的细胞。
4. 用移液管将冻存管内液体全部移入 15 ml 锥形管中。以大约每 10 秒 3-5 滴的速度，小心地加入 5 至 10 ml 预热的 PRIMEXV MSC Expansion XSFM，每次加入后轻轻摇晃锥形管。
5. 将锥形管内全部溶液转移到 Cellnest 包被的组织培养容器中。
6. 在 37°C, 5% CO₂，加湿的环境中培养细胞。
7. 复苏后 24 小时，吸出培养基，补充预热的 PRIME-XV MSC Expansion XSFM。
8. 每两天，吸出并丢弃已使用培养基，补充预热的 PRIME-XV MSC Expansion XSFM 培养细胞。
9. 当细胞达到 70%～80% 汇合时传代。请不要培养至细胞完全汇合或过度汇合。次优条件下的传代培养可能会影响产品性能。

在 PRIME-XV MSC Expansion XSFM 中传代培养人 MSCs

1. 按照包被方案，将组织培养容器用 PBS 稀释后的 Cellnest 预包被，终浓度为 20μg/cm²。
2. 预热 PRIME-XV MSC Expansion XSFM 至 37°C。
3. 从 T75 瓶（例如）中吸出培养基，每个 T75 瓶用 10 ml PBS (FISI，货号 9240）轻轻冲洗细胞一次。
4. 在每个 T75 瓶中加入 5 ml 室温 TrypLE Express，并向各个方向倾斜，使 TrypLE Express 均匀地分散在细胞上。
5. 在 37°C, 5% CO₂ 培养箱中培养细胞。通过在显微镜下观察细胞，定期监测细胞脱离情况。细胞会开始变圆并分离。轻拍培养瓶的侧面以帮助细胞分离，然后将培养瓶放回培养箱。重复上述过程，直到至少 90% 的细胞完全分离。这个过程大约需要 5 到 10 分钟。
6. 向培养瓶中加入 5 ml PRIME-XV MSC Expansion XSFM。使培养基分布在培养瓶的整个生长表面，使细胞分散，然后将培养瓶内混合物转移到 15 ml 的锥形管中。
7. 以 400xg 离心细胞 5 分钟。吸去上清液。
8. 将细胞沉淀重悬于少量预热的 PRIME-XV MSC Expansion XSFM 中，用细胞计数仪计数。
9. 对每个包被的 T75 瓶，将 4.5 - 5.5×10⁵ 个细胞重悬到 20 ml 预热的 PRIME-XV MSC Expansion XSFM 中。注：建议在 2 维预包被培养容器中以约 6000 cells/cm²/0.2-0.3 mL 密度接种细胞。
10. 10. 轻轻地从培养瓶中吸出涂层溶液，慢慢地将细胞悬浮液加入 T75 瓶中。吸掉溶液时，避免刮伤涂层表面。在 37°C 和 5%CO₂ 的湿润环境中培养细胞。
11. 吸出并丢弃已使用培养基，每 2 天用预热过的  PRIME-XV MSC Expansion XSFM 补充。