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        🔥 免疫组化染色实验(IHC)

        相关实验:免疫组化

        别名:免疫染色,组织(化学)染色, 免疫组化

        最新修订时间:

        丁香实验推荐阅读

        合作专家 | 雷庆强硕士

        免疫学 四川大学

        丁香实验推荐阅读

        审核专家 | 张旭娟博士

        生物医学工程 北京工业大学

        原理

        免疫组织化学技术是应用免疫学及组织化学原理,对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究。

        通过抗原抗体反应及呈色反应,显示细胞或组织中的化学成分,在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物,从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。

        组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质,如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。

         

        用途

        检测组织中某蛋白的表达,包括其表达与否、表达位置和相对含量。

        材料与仪器

        1. 1xPBS 缓冲液(pH 7.2~7.4):NaCl 137 mmol/L, KCl 2.7 mmol/L,Na2HPO4 4.3 mmol/L, KH2PO4 1.4 mmol/L。

        2. CB:柠檬酸三钠 3 g, 柠檬酸 0.4 g。

        3. 1% 盐酸酒精分化液:按体积比为浓盐酸:无水乙醇 = 1:99 配制。

        4. NGS:正常山羊血清,10% 及 1% NGS 用 1xPBS 稀释。

        5. 苏木素染色液:苏木精粉 0.5 g,铵矾 24 g,蒸馏水 70 ml,NaIO 31 g,水 5 ml,再加入甘油 30 ml 和冰醋酸 2 ml,混合均匀,滤纸过滤。

        6. 一抗、二抗按需选择购买,尽量参考高分文献。

        仪器:烤片机、通风橱、免疫组化染色缸或盒、微波炉、湿盒、显微镜、微波炉。

        步骤

        (若非石蜡切片直接进行第 4 步梯度水化即可)

        (若为冰冻切片,则进行以下步骤后直接进行第 5 步内源性过氧化物酶阻断:

        一、样本处理

        1、加固定剂(按下述固定剂选择固定条件):

        10% 中性缓冲福尔马林:在室温下固定 10 min。

        冷冻丙酮:-20 ℃ 冷冻 10 min,风干。

        甲醇:-20 ℃ 冷冻 10 min。

        3% 甲醛:室温下固定 15 min。

        3% 甲醛/甲醇:在 3% 甲醛溶液中室温固定 15 min,之后直接放入甲醇溶液中 -20 ℃ 固定 5 min。

        2、1xPBS 清洗 2 次,每次 5 min。

         

        二、IHC 流程

        1. 选取质量较好,厚度均匀的组织切片并做好标记,同时设立一张阴性对照切片;使用不同抗体的切片尽量选取连续切片,避免因组织差别大而影响结果分析的客观性;

        2. 石蜡溶解:将切片置于 70 ℃ 原位杂交仪中,烤片 30 min (无烤片条件也可忽略此步直接进行 ,适当增加脱蜡时间);

        3. 脱蜡:将烤过后的切片迅速放入二甲苯中,2 次,各 5 min;

        4. 梯度水化:100%、90%、80%、70% 的乙醇中各放置 5 min,蒸馏水中放置 5 min;

        5. 内源性过氧化物酶阻断:滴加 3% 过氧化氢,室温于湿盒内放置 10 min 后,蒸馏水中放置 1 min;

        6. 抗原修复:放置于 CB 中,微波炉 80% 火力 4 min,40% 火力 8 min,冷却至室温;

        7.(可选步骤)0.3% Triton 室温通透 15 min;

        8.  封闭:吸干组织周围液体,滴加 10% NGS,放置于湿盒内,37 ℃ 30 min 或室温 2 小时;

        9.  一抗:按抗体说明书建议比例使用 1% NGS 稀释抗体;吸干组织周围液体,滴加稀释好的一抗,阴性对照组仅滴加 1% NGS,放置于湿盒内,37 ℃ 孵育 2 小时,或 4 摄氏度过夜;

        10. 放置于 1xPBS 中清洗 3 次,每次 5 min;

        11.  二抗:吸干组织周围液体,滴加二抗,主要分为以下两种:

        A. 酶标法检测:滴加酶标山羊抗兔/鼠 IgG 聚合物(依据一抗种属来源选择),37 ℃ 孵育 20 min;1xPBS 清洗 3 次,每次 3 min。

        B. 生物素化检测:滴加生物素标记山羊抗兔/鼠 IgG 工作液(依据一抗种属来源选择),37 ℃ 10~15 min;1xPBS 清洗 3 次,每次 3 min;滴加碱性磷酸酶标记链霉卵白素,37 ℃ 10~15 min。

        12. DAB 显色:吸干组织周围液体,滴加适量 DAB 或 AEC 显色液,室温 5~8 min,显微镜观察颜色;

        13. 核染:自来水冲洗后,吸干组织周围液体,滴加苏木素染色液,染色 5 min,流水冲洗掉苏木素染液,显微镜观察染色程度;

        14. 分化:1% 盐酸酒精分化 1~3 s,水洗,置于自来水中浸泡返蓝 5~10 min;显微镜观察颜色,若颜色不够深可直接滴加苏木素染色液复染 1 min 后,再次分化立即水洗;若过深则适当增加分化时间;

        15. 梯度脱水:80%、90%、95% 和 100% 乙醇进行脱水;

        16. 透明:二甲苯 2 次,各 5 min,室温晾干;

        17. 封片:滴加一滴中性树胶于组织上,盖玻片封片。24 h 后置于显微镜下观察拍照。

        🔥 免疫组化染色实验(IHC)

        图 1. 皮肤 Col-XVII 的 IHC 结果示例,可看到皮肤上皮真皮紧密连接层 Col-XVII 阳性(棕色),蓝色为细胞核

        https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-1822552/v1 中 Fig.3 G

         

        🔥 免疫组化染色实验(IHC)

        图 2. 泪腺组织 MIF 的 IHC 结果示例,棕色为阳性细胞,蓝色为细胞核 DOI:

        https://doi.org/10.21467/ias.4.1.27-34

        注意事项

        1.  注意充分脱蜡,脱蜡不彻底易造成染色难,染色不均匀,组织细胞结构层次不清晰。

        2. 不同组织染色难易程度有差别,染色时注意镜检,灵活调整染色时间。

        3. 可以将内源性过氧化物酶阻断步骤在抗原修复之后进行。

        4. 确定蛋白表达位置,并与阴性对照对比,避免假阳性,部分蛋白(仅限 human)的 IHC 结果可参考 https://www.proteinatlas.org/.

        常见问题

        1. 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象:

        烤片时间不够,或温度不够,可以延长烤片时间和提高烤片温度;用含有多聚赖氨酸的玻片制作切片;有些组织本身就容易掉片,如骨组织等,操作时冲 PBS 不要直接冲到组织上,冲到组织上方,让它流下冲洗组织;用 CB 高温修复时,尽量避免 CB 沸腾,修复完成后自然冷却至室温,避免骤冷引起脱片。


        2. 产生组织切片非特异性染色

        ① 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制;

        ② 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色,建议试用单克隆抗

        来源:丁香实验

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