🔥 细胞转染和分析

细胞转染是指将外源分子如 DNA、RNA 等导入真核细胞的技术。可以分为瞬时转染和稳定转染，两种方法的优缺点比较如下：瞬时转染生产迅速、周期短、成本低、表达效率高，不需要筛选基因，但不能长期表达基因；对一些难转染的细胞来说，表达效率低，稳定转染能长期表达，得到稳转株后成本降低，适用于难转染的细胞，成本较高、周期长、操作步骤多。

根据某个基因在细胞内表达时间的长短或该基因整合进细胞内的方式，细胞转染可分为瞬时转染和稳定转染。

瞬时转染指的是：通过脂质体、磷酸钙、电穿孔等方法，将构建好的质粒通过转染试剂导入到细胞内，该质粒上的外源基因不整合到细胞自身的基因组上。

随着细胞的生长分裂，外源基因逐渐丢失。质粒在细胞内能够存在 3~4 天，此时间内，质粒外源基因在细胞内发生转录翻译，得到极为少量的蛋白。

稳定转染通常指的是利用病毒载体，将外源基因整合到细胞基因组上，通过筛选得到稳转细胞株，使外源基因成为细胞基因组的一部分而得以复制，能够长期的表达某基因。

通过瞬转与稳转达到基因的敲低与过表达。

一、瞬时转染法

1、提前一天晚上将 293T 细胞铺板至 6 cm 皿中，铺板量以转染时达到 80% 左右为宜；

2、转染细胞。准备两个 EP 管，一个加入 240 μL HBS 以及待转染的质粒，另一管加入 155 μL HBS 以及 25 μL PEI 转染试剂，在涡旋混合仪上震荡混匀两管，静置 5 分钟；

3、将两个 EP 管里面的液体混合至一个管子中，再次震荡，室温静置 15 分钟；

4、在超净台中，将转染体系加入至 293T 细胞中，混匀培养基和转染体系，放入培养箱中，继续培养；

5、6 小时后更换新鲜的培养基，24 小时后检测基因的表达情况。

二、稳定转染法

1、稳转之前需得到病毒液，只需要将上述瞬转步骤中的质粒换成相应的病毒载体质粒以及病毒衣壳蛋白的表达质粒；

2、换液后，继续培养 48 小时，在生物安全柜中取出培养基至 5 mL EP 管，离心后，转移至 5 mL 注射器中，通过 0.45 μm 滤头过滤病毒，并分装至 1.5 mL EP 管中；

3、感染前一天晚上将细胞铺板至 6 孔板中，密度至感染时达到 50%~60%，将过滤的病毒和培养基以 1:1 的比例加入细胞中，并加入 2 μL pb 促感染；

4、感染 48 小时后，消化细胞并用相应的抗生素进行筛选；

5、传 2~3 代后，检测细胞稳转的效率。

1、每一种试剂都有相应的实验步骤，不同的细胞应该根据其特性，选择经济高效的转染试剂；

2、稳转过程中会产生病毒，需要在生物安全柜以及有相应资质的实验室进行，相应的器皿不能随意丢弃，应集中回收灭菌后在丢弃。

1、转染效率低或者检测不到表达？

1）确认该质粒构建无误；

2）提高转染质粒的质量；

3）调整转染时细胞密度以及转染试剂的用量；

4）更换转染试剂或用稳转的方法。

2、血清。

血清影响复合物的形成，降低转染效率原因是阳离子脂质体和 DNA 的最佳量在使用血清时会有所不同，因此想在转染培养基中加入血清时要进行条件优化。

大部分细胞可以在无血清培养基中几个小时内保持健康，对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用 OPTI-MEM I 培养基。对于对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用 LIPOFECTAMINE 2000。