细胞转染

一、细胞传代1. 试验准备：200 ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。2. 弃掉培养皿中的培养基，用1 ml的PBS溶液洗涤两次。3. 用Tip头加入1 ml Trypsin液，消化1分钟（37℃，5%CO2 ）。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。4. 加入1 ml的含血清培养基终止反应。5. 用Ti

1.传代细胞准备　细胞在转染前24 h传代，待细胞密度达50%～60%满底时即可进行转染。加入沉淀前3～4 h，用9 ml完全培养液培养细胞。2.DNA沉淀液的准备　首先将质粒DNA用乙醇沉淀（10～50 μg/10cm平板），空气中晾干沉淀，将DNA沉淀重悬于无菌水中，加50 μL2.5 mol/L CaCl2。3.用巴斯德吸管在500 μL　2×HeBS中逐滴加入DNA-CaCl2溶液，同时

细胞转染是指将外源分子如 DNA、RNA 等导入真核细胞的技术。可以分为瞬时转染和稳定转染，两种方法的优缺点比较如下：瞬时转染生产迅速、周期短、成本低、表达效率高，不需要筛选基因，但不能长期表达基因；对一些难转染的细胞来说，表达效率低，稳定转染能长期表达，得到稳转株后成本降低，适用于难转染的细胞，成本较高、周期长、操作步骤多。

（1）准备 siRNA-脂质体复合物：于 3 个 1.5 mL 无菌 EP 管中分别加入 250 μL、250 μL 和 500 μL Opti-MEM 培养基（tube1、tube2 和 tube3），于含 500 μL Opti-MEM 培养基的 tube3 中加入 30 μL LipofectamineTM RNAiMAX，轻柔震荡混匀；于含 250 μL Opti-MEM 培养基的 2 个

（1）处理细胞，将细胞接种于 6 孔板中，密度 30~40%；（2）置于细胞培养箱培养 16~20 h，PBS 润洗，更换 1 mL 新鲜培养基；（3）滴加 1 mL 相应的病毒悬液（对照病毒/过表达目的病毒）；（4）置于细胞培养箱，孵育 24 h，PBS 润洗，更换 1 mL 新鲜培养基；（5）置于细胞培养箱，孵育 48 h，使用已经确定的细胞最低致死浓度嘌呤霉素进行筛选；（6）连续培养 1~2

慢病毒转染是一种常见的，在一种细胞系中稳定敲除/表达某种基因的方式。

1、细胞分盘：通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基以 4×105 至 8×105 细胞/cm2 的密度平铺细胞于 60 mm 组织培养皿上（根据实验需要选择培养皿，使细胞贴壁后所占总面积达到培养皿面积的 70~90％）。根据细胞贴壁情况于含 5％ CO2 的 37 ℃ 温箱中孵育 8~24 h，当细胞贴壁完全后即可开始转染。转染前换入 2 mL 预热的无血清培养基。2、制备 PEI-DNA 混