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        共有序列巢式 PCR

        相关实验:巢式 PCR

        别名:consensus nested PCR,共有引物巢式 PCR,consensus primer nested PCR

        最新修订时间:

        简介

        共有序列巢式 PCR (consensus nested PCR), 又称为共有引物巢式 PCR (consensus primer nested PCR), 根据同一种属内较为保守的序列,设计简并引物,通常第一轮 PCR 引物的简并碱基较多,第二轮 PCR 引物的简并碱基较少一些,扩增长度为 200~300 bp。

        原理

        共有序列巢式 PCR 的基本原理是利用软件进行严格的序列对比分析,从中找出保守的序列,在这部分序列中可能仍存在一些核苷酸的多样性,则在具有多样性核苷酸的位置上设计为简并碱基,将所出现的所有核苷酸多样性均要考虑,第二轮 PCR 扩增产物长度控制在 200~300 bp 左右。由于引物中简并碱基较多,要摸索适合的退火温度。

        用途

        共有序列巢式 PCR 的常用应用领域如下:

        (一)测序获得未知微生物的信息

        对于某一种生物,例如病毒,种属内型别很多,但检测样本中的病毒型别又不确定,使用共有序列巢式 PCR 扩增获得目的序列,进而通过测序获得未知微生物的信息,是一种敏感而又简便易行的检测方法。

        材料与仪器

        器材:PCR 扩增仪、电泳仪

        试剂:

        ① 模板: 基因组 DNA 或 cDNA

        ② 2.5 mmol/L dNTP 混合液

        ③ 10 umol/L 四条特异引物: 两条外引物,两条内引物

        ④ TaqDNA 聚合酶及其 10× PCR 缓冲液

        ⑤ 高压灭菌去离子水

        步骤

        共有序列巢式 PCR 的基本过程可分为如下几步:

        (一)引物设计

        在共有序列巢式 PCR 中,引物设计最为重要。选择同一种属序列最为保守的区域,根据序列比对情况,设计引物。

        (二)共有序列巢式 PCR 反应

        A. PCR 反应体系:

        设立 50 pl 的 PCR 反应体系,在 0.25 ml 的 PCR 管中,分别加入:

        10× PCR 缓冲液 5 μl

        DNA 模板 5 μl

        2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl

        Taq DNA 聚合酶 (5 U/μl) 0.5 μl

        10 μmol/L 的外引物 (P1、P2) 各 1 μl

        H2O 至 50 μl

        如果 PCR 仪没有热盖,在反应液上加一滴矿物油 (约 50 μl)。将 PCR 试管放入到 PCR 仪上。

        B. 设置 PCR 反应条件:

        预变性 94 ℃,3 min

        变性 94 ℃,30 s

        退火 55 ℃,30 s 30 个循环

        延伸 72 ℃,60 s

        延伸 72 ℃,7 min

        PCR 反应中的温度要根据具体反应而定,一般来说每分钟合成 1000 bp 左右。

        C. 进行第二轮 PCR 反应,在 0.25 ml 的 PCR 管中,分别加入:

        10× PCR 缓冲液 5 μl

        第一轮 PCR 产物 5 μl

        2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl

        Taq DNA 聚合酶 (5 U/μl) 0.5 μl

        10 μmol/L 的正反向内引物 (P3 ,P4) 各 1 μl

        H2O 至 50 μl

        PCR 反应条件同第一轮。

        D. PCR 产物的检测

        反应结束后,用 10 μl 第二轮 PCR 反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析。

        注意事项

        1. 引物设计尤为重要,在引物设计之前要搜集可能相关的所有 DNA 序列,利用软件进行严格的序列比对分析,从中找出最保守的序列,在这部分序列中可能仍存在一些核苷酸多样性,则在具有多样性核苷酸的位置上设计为简并碱基,将所出现的所有核苷酸多样性均要考虑,第二轮 PCR 扩增产物长度控制在 200~300 bp 左右。

        2. 由于引物中简并碱基较多,要摸索适合的退火温度。

        来源:丁香实验

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