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        Protein A/G 亲和层析法纯化单克隆抗体

        最新修订时间:

        简介

        目前约70%-80%的抗体纯化使用Protein A/G亲和层析法。Protein A与IgG的结合强度很大程度上依赖于该抗体的种属和亚类(参见表7-2),而Protein G对于大多数哺乳动物的IgG则有着更高的亲和力,因此,Protein G可用于纯化不能与Protein A很好结合的哺乳动物单抗或多抗IgG的纯化。


        Protein A/G 亲和层析法纯化单克隆抗体

        原理

        Protein A/G 亲和层析法纯化单克隆抗体的基本原理是 Protein A/G 能特异性地与抗体的 Fc 段结合,因此 Protein A/G 亲和层析柱可用于抗体(单抗和多抗)的分离纯化,具有极高的选择性。经过一步亲和层析,即可从腹水、杂交瘤培养上清或免疫血清等样品中得到高纯度(>95%)的抗体。


        材料与仪器

        器材:Protein A/G 亲和层析柱,FPLC 层析系统。


        试剂:
        ① 上样缓冲液:0.02mol/L PBS,pH7.4。
        ② 洗脱液:pH3.0-4.0、0.02mol/L 柠檬酸缓冲液,或 pH3.0、0.2mol/L 甘氨酸-HC1 缓冲液。
        ③ 再生液:0.1mol/L 乙酸


        步骤

        Protein A/G 亲和层析法纯化单克隆抗体的基本过程可分为如下几步:


        A 样品预处理:小鼠腹水于 4℃、12000 r/min 离心 15 分钟,以除去较大的凝块。经上样缓冲液倍比稀释后,0.45μm 滤膜过滤。
        B 平衡:以 1 ml/min 的流速,用 5-10 倍层析柱体积的上样缓冲液平衡层析柱,至流出液 pH 值为 7.4。
        C 上样:预处理过的腹水上层析柱,保持 1 ml/min 流速,继续用上样缓冲液流洗 5~10 倍层析柱体积至基线稳定(即杂蛋白完全洗脱)。
        D 洗脱:用洗脱液洗脱柱结合抗体,同时应用 FPLC 层析系统进行实时监测,当观察到基线开始上升,即出现洗脱峰时,每管 3 ml 收集流出液,直至洗脱峰回到基线,并立即用 1.0mol/L pH9.0 的 Tris-HC1 缓液调整收集的各管流出液 pH 值至 7.0。
        E 再生:保持 1 ml/min 流速,用 3~5 倍层析柱体积的再生液淋洗柱子。
        F 平衡:继续用 5~10 倍层析柱体积的上样缓冲液重新平衡层析柱,至流出液的 pH 呈中性,再用 10 倍层析柱体积的三蒸水平衡,可重复使用。
        G 浓缩:合并调至中性的各管洗脱液,采用超滤离心管进行浓缩,最后以 0.15mol/L PBS(pH7.4)调整到合适体积,行 SDS-PAGE 鉴定纯度,BCA 法进行抗体定量,分装冻存。

        注意事项

        1 纯化前所有缓冲液、样品及层析柱都必须平衡至室温,以避免产生气泡。

        2 纯化前样品、缓冲液须用 0.45μm 滤膜过滤去除颗粒性物质,以防层析柱被堵塞而降低纯化效果。

        3 使用经饱和硫酸铵粗纯的样品不仅可获得更好的纯化效果,还可适当延长亲和层析柱的使用寿命。

        4 加样后,让样品在亲和柱内滞留一定时间(约 30 分钟)可提高亲和柱的纯化效率。

        5 在酸性条件下洗脱的抗体必须立即中和到中性(pH7.0 左右),以利于维持抗体的生物学活性,避免抗体失活。

        6 在使用和保存层析柱时,应避免柱内液体流干,以防气泡进入。

        7 为确保层析柱的使用寿命和载量,及时清洗非常重要,清洗完成后用上样缓冲液重新平衡。

        8 层析柱可于 4℃、20% 乙醇中长期保存。

        来源:丁香实验

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