比色法（二喹啉甲酸法）测定蛋白质总含量

相关实验：基于蛋白质化学呈色反应测定蛋白质总含量

最新修订时间：2022-02-10

简介

二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid assay，BCA 法）是一种类似 Lowry 法的蛋白定量方法，该方法只需一步反应且不易受其他物质干扰。

原理

比色法（二喹啉甲酸法）测定蛋白质总含量的基本原理是在碱性溶液中，蛋白质中的肽键能与 Cu²⁺反应生成 Cu⁺，BCA试剂能与 Cu⁺反应形成稳定的紫色复合物，并在 562nm 有很强的吸收峰。

材料与仪器

器材：分光光度计、比色杯、37℃恒温水浴、微量移液器、离心管、振荡器

试剂：

①溶液 A：1％ BCA，2％Na₂CO•H₂O，0.16％酒石酸钠 •2H₂0,0.4％NaOH，0.95％NaHCO₃，加水至 1L，用 NaOH 调节 pH 值至 11.25，室温保存

②溶液 B：4％ CuSO₄•5H₂0，加去离子水至 50ml，室温保存

③NaOH 溶液：2mol／L、0.2mol／L、0.1mol／L

④蛋白标准品：2mg／ml BSA。

步骤

比色法（二喹啉甲酸法）测定蛋白质总含量基本过程可分为如下几步，本方法以二喹啉甲酸法的微量测定为例介绍二喹啉甲酸法技术的全过程。

A．准备蛋白标准品取适量的标准 BSA 溶液（2mg／ml），加入等体积 0.2mol／L NaOH 并混匀，按表 Ⅲ-1 制备不同浓度的蛋白标准品，每个浓度准备 2 管。

B．准备待测蛋白质样品如为液体样品，样品用 H2O 做不同浓度的稀释（或不稀释）。加入与稀释后样品等体积的 0.2mol／L NaOH，使样品的显色保持在可测量的范围内。如为固体样品，样品以 2mol／L NaOH 溶解，将溶解后的样品用水10倍稀释，再按可检测到的适宜浓度用去离子水稀释样品，使样品的显色保持在可测量的范围内，NaOH 的终浓度为 0.1mol／L。

C．测定

（1）取 50 倍体积的 A 液，加入 1 倍体积的 B 液，迅速混匀。按照需要的总量配制工作液，配好的工作液于室温放置，1 天内可以使用。

（2）在已准备好的标准品和待测样品中各加入 1.0ml 工作液，立即混匀。

（3）37℃ 恒温水浴 30 分钟（测量范围：20～2000μg／ml），或室温 2 小时（测量范围：20～2000μg／ml），或 60℃ 水浴 30 分钟（测量范围：5～250μg／ml）。

（4）将保温后的所有试管冷却到室温。室温下读取各管在 562nm 波长处的吸光度（As62）。

（5）将标准品管和待测样品管的读数减去空白管读数，得到校正后各管的 As62 值。

（6）以各标准管蛋白含量为横坐标，各标准管的 As62 值为纵坐标，绘制标准曲线。

（7）根据各样品管的 As62 值从标准曲线上查出样品的蛋白量，该数值乘以蛋白质样品的稀释倍数，即为蛋白质样品的实际蛋白质含量。

注意事项

1．过浓的待测样品需要进行稀释稀释有以下作用：

①降低干扰物的浓度，如必须使巯基乙醇的浓度＜0.01％、DTT＜1mmol／L、SDS＜5％、脱氧胆酸＜5％、甘氨酸＜lmmol／L、尿素＜3mol／L、EDTA＜10mmol／L、NaCl＜1mol／L；

②使样品完全溶解；