比色法（Lowry法）测定蛋白质总含量

相关实验：基于蛋白质化学呈色反应测定蛋白质总含量

最新修订时间：2022-02-10

简介

Lowry 法是 O．Lowry 于 1951 年在 Folin 酚试剂法和双缩脲法的基础上建立的蛋白质含量分析法，因此也称为 Lowry 改良法。这一方法在 20 世纪 50 年代到 90 年代中期一直作为蛋白质含量分析的主要方法。

原理

比色法（Lowry法）测定蛋白质总含量的基本原理涉及两步反应，第一步反应是基于原双缩脲测定法，即在碱性溶液中蛋白质中的肽键与 Cu²⁺反应形成紫色的络合物（两个以上肽键接近存在的情况下，在强碱性一侧与 Cu²⁺形成络合盐），其颜色的深浅与蛋白质的含量成正比；第二步反应是基于酚试剂（磷钼酸和磷钨酸混合液）被蛋白质中的芳香族氨基酸（色氨酸和酪氨酸）残基还原，反应呈现深蓝色。

用途

只要干扰物质的含量在允许浓度以下，Lowry 法就适用于所有透明溶液中总蛋白含量的分析。Lowry 法的蛋白质定量范围为 1～15μg／ml。Lowry 法目前仍然是较常用的蛋白质定量分析方法，例如，我国目前规定，在生物制品检定中应采用 Lowry 法确定产品的蛋白含量。

在细胞信号转导研究中，常常需要在细胞裂解缓冲液中加入各种非离子去垢剂以溶解膜结合蛋白。这些非离子去垢剂对蛋白质含量分析干扰很大，常不能准确反映蛋白质的含量。商业公司的测定试剂盒中除碱溶液和稀释的 Folin 试剂外，还提供了另一种试剂（Solution S），可以消除非离子去垢剂的影响。

在细胞生物学，尤其是在细胞信号转导研究中，能够用于实验的样品量有限，可以采用微量法进行测定。最小允许容积取决于所使用的分光光度计及比色杯的最小允许容积，有的仅需 100μl 即可。

材料与仪器

器材：分光光度计

试剂：

①细胞裂解缓冲液

②标准蛋白质溶液

③Solution A

④Solution S

步骤

比色法（ Lowry法）测定蛋白质总含量基本过程可分为如下几步：

所有蛋白质含量测定的比色法都属于相对定量分析，必须将样品的颜色反应与已知蛋白量的标准品相比较，才能计算出样品中的蛋白含量。因此，用Lowry法等比色方法进行蛋白质含量分析时，需要同时用一系列倍比稀释的已知蛋白含量的标准品溶液做一个颜色深浅程度与蛋白含量的关系曲线，这一曲线被称为标准曲线（图 10-5）。利用这一曲线可以根据待测样品溶液的呈色强度计算出其中的蛋白含量（实验流程 10-2）。

比色法（Lowry法）测定蛋白质总含量

实验流程10-2 Lowry法测定含有非离子去垢剂样品的蛋白含量（微量法）
A．准确称量标准品蛋白，用与样品相同的细胞裂解缓冲液溶解，使其浓度为5mg／ml。以此浓度开始，用细胞裂解缓冲液将标准品蛋白稀释为下表中的各个蛋白质浓度，每个浓度50μl为宜。
B.适当稀释样品（凭经验或做数个不同稀释浓度）。
C．准备 SolutionA＇：根据样品数量取出适量Solution A，按照每毫升 Solution A 加入 30μl Solution S的比例混合即成Solution A＇。
D.按下表在微量离心管内分别加入各试剂（单位为μl）：
管号	1	2	3	4	5	6	7	8
标准蛋白质溶液	-	15.0	15.0	15.0	15.0	15.0	15.0	-
（蛋白质浓度mg／ml）	0.0	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0	1.2	待测
待测样品	-	-	-	-	-	-	-	15.0
样品缓冲液	15.0	-	-	-	-	-	-	-
Solution A'	75.0	75.0	75.0	75.0	75.0	75.0	75.0	75.0
Solution B	600.0	600.0	600.0	600.0	600.0	600.0	600.0	600.0
E．室温放置15min。
F．用分光光度计在750nm波长处以1号管调零点，再测定各管吸光度（A）。
G.以吸光度值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，用手工或用计算机绘制标准曲线，根据标准曲线计算
出待测样品中的蛋白含量（如样品经过稀释，应注意计算稀释前的蛋白含量）。