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        酶桥法

        相关实验:非标记抗体免疫酶组织化学实验

        最新修订时间:

        原理

        首先用酶免疫动物制备成效价高、特异性强的抗酶抗体。在特异性抗体与抗酶抗体之间利用第二抗体作「桥梁」,将它们连接起来,再将酶结合在抗酶抗体上,经显色显示抗原的定位。

        其基本流程为:抗原+特异性抗体 → 第二抗体(桥抗)→ 抗 HRP 抗体 → HRP → DAB+H2O2(显色)。

        因为桥抗体对特异性抗体的量是过剩的,与特异性抗体结合后还剩有抗原结合位点,能与抗酶抗体结合,所以桥抗体能起到连接特异性抗体和抗酶抗体的作用。在此过程中,酶是利用免疫学原理与抗酶抗体结合的,从而避免了由于酶标记抗体而引起的酶和抗体的活性损害,提高了方法的敏感性,降低了非特异性染色。染色原理见图 4-7。

        材料与仪器

        步骤

        1. 石蜡切片脱蜡至水,冰冻切片或细胞涂片经丙酮固定 10 min,PBS 洗 3 min × 3 次。


        2. 滴加 0.3% H2O2 甲醇液,室温处理 20 min,PBS 洗 3 min × 3 次(抑内源性过氧化物酶活性)。


        3. 0.1% 胰蛋白酶 37°C 消化 20 min 或 AR(只限于石蜡片),PBS 洗 3 min × 3 次。


        4. 滴加 1:(5~20)正常羊血清或牛血清 20 min(室温或37℃),吸去多余血清,不洗。


        5. 适当稀释的特异性一抗(例如来自种属 A)37℃ 孵育 60 min 或 4℃ 过夜,PBS 洗 3 × 3 min。


        6. 第二抗体(也称桥抗体,抗种属 A 的 IgG 抗体)37℃ 孵育 40 min,PBS 洗 3 × 3 min。


        7. 抗酶抗体(来自种属 A)37℃ 孵育 40 min,PBS 洗 3 × 3 min。


        8. 酶(HRP 70~100 μg/ml,PBS 溶解)37℃ 孵育 40 min,PBS 洗 3 × 3 min。


        9. 0.04% DAB + 0.03% H2O2 显色 8~12 min,最好在光镜下控制。


        10. 充分水洗,苏木精复染,盐酸乙醇分化 15~30 s。


        11. 常规树胶封片,结果观察。

        注意事项


        来源:丁香实验

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