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        三磷酸胶瞽酶钙―钴法

        互联网

        1798
        三磷酸胶瞽酶钙―钴法
         
          三磷酸腺苷酶 可水解磷酸与磷酸之间的高能键,而释放大量能量,而磷酸酶是酯 ,能水解磷酸与碳酸之间的键。反应式如下:
         
            A--P~P~P+H2 O ATPase A―P―P+ H3 PO4 +能量
         
            在生物膜上,ATP酶的功能是参与离子泵的主动运输,因此细胞膜呈强阳性,ATP酶可作为肝细胞早期受损的敏感指标。此酶活性在心肌最高,其次为骨骼肌、肺、肾脏、脑和胰腺。由于各种ATP酶的最适pH值不同,故所用显示方法也不同。下面仅介绍显示Ca2+ ATPase的钙―钴法。
        三磷酸腺苷酶钙―钴法类似碱性磷酸酶的钙―钴法,但底物改用三磷酸腺苷钠盐,最适pH 9.4,对ATP酶型Mg2+ 具有抑制作用。
         
            1.孵育液配制
            0.1mol/L巴比妥钠(pH 9.4)                2.0ml
            三磷酸腺苷二钠盐                          30mg
            蒸馏水                                    1.0ml
            0.18mol儿氯化钙                          1.0ml
            0.1mol/LNaOH调至pH 9.4,蒸馏水加至      10ml
         
            2.染色程序
            (1)新鲜组织冷丙酮固定30分钟,冰冻切片;
            (2)人孵育液(新鲜配制)37~C孵育3小时后蒸馏水漂洗;
            (3)1%CaCl2 溶液洗2分钟;
            (4)蒸馏水洗;
            (5)1%CaCl2 溶液洗2分钟;
            (6)流水洗;
            (7)人1%硫化铵1分钟;
            (8)流水洗;
            (9)干燥后梯度乙醇脱水,二甲苯透明;
            (10)甘油明胶封固。
         
            3.结果  酶活性处显示黑棕色。
         
            4.对照实验   ①用β―甘油磷酸钠代替ATP钠盐应为阴性;②孵育液中加入ι―四咪唑抑制碱性磷酸酶排除假阳性;③去底物。
         
            5.注意事项  此法要求Ca:―浓度在孵育前后不能降低,否则产生的磷酸根离子不能被完全捕获而影响准确定位。如染色效果不好可在孵育前将切片放入1%CaCl2 溶液中,37℃作用5分钟。
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