原理
材料与仪器
步骤
实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」
1. 对每一组 ds cDNA （A 和 B）配制 2 个限制性内切核酸酶消化反应（AluI 和 AluI＋Rsal）：
30 ng ds cDNA
3 ul 10×AluI 缓冲液
10 U AluI 或 10 U AluI＋10 U RsaI
加水到 30.0 ul。
37℃ 温育过夜，确保完全消化。
最好使用产生平端的酶。如果不是产生平端的酶，需要另外补平或削平。
2. 65℃温育超过10 min失活内切酶。
3. 激酶处理寡核苷酸 a1 和 b1， 使用如下反应体系（每个反应体系 25 ul）：
18.0 ul H2O
2.5 ul 10 mmol/L ATP
2.5 ul 10×T4 多聚核苷酸激酶缓冲液
1.5 ul 3 ug/ul 的寡核苷酸 a1 或 b1
0.5 ul 10 U/ul T4多聚核苷酸激酶
37℃ 温育 60 min。
4. 65℃温育20 min失活激酶。
5. 加入 1.5 ul 的寡核苷酸 a2 或寡核苷酸 b2 形成 a1/a2 或 b1/b2 连接子。混匀，最高速离心。45℃ 温育 10 min。
6.在 0.5 ml 的 PCR 管里，用合适的连接子为每组 cDNA 配制连接反应（130 ul 每个反应）：
63 ul H2O
13 ul 10× T4 DNA 连接酶缓冲液
30 ul 40％ PEG 8000
1ul 15 mmol/L ATP
10 ul AluI 消化的 cDNA
10 ul AluI/RsaI 消化的 cDNA
2 ul a1/a2 或 b1/b2 连接子
1ul 10 U/ul T4 DNA 连接酶
混匀，16℃温育2 h。
7. 将反应管放于冰上超过10 min。
8. 根据厂家说明书准备 Sephacryl S-300 离心柱。
9. 每个连接反应中加入 1 ul 75 mmol/L 的 ATP 和 1 ul T4 多聚核苷酸激酶。37℃ 温育 30 min。
10. 用 1 倍体积的 25：24 的苯酚/氯仿和氯仿依次抽提连接反应。
11. 连接产物离心过 Sephacryl S-300离心柱 ，除去未连接的连接子，用 Beckman Accuspin FR 离心机的吊桶转子室温，400 g 离心 2 min。
12. 两组 cDNA ， 各配制 50 ul PCR反应体系：
35 ul H2O
5 ul 10×Taq DNA 聚合酶缓冲液
3 ul 25 mmol/L MgCl2
1 ul 10 mmol/L 4dNTP 混合物
0.5 ul 2.5 ug/ul 寡核苷酸 a2 或寡核苷酸 b2
5 ul 0.2 ng/ul 连接好的 cDNA A 或 cDNA B
0.5 ul 5 U/ul Taq DNA 聚合酶
加入几滴无菌的 PCR 级的矿物油覆盖反应体系。
13. 用下面的 PCR 程序扩增 cDNA ：
30 个循环：
1min 94℃ （变性）
1 min 50℃ （复性）
2 min 72℃ （延伸）
25 s 72℃ （自动延伸）
对于没有自动延伸的热循环仪，延长延伸时间为 2～4 min。
14. 用琼脂糖凝胶电泳分析 5～10 ul 扩增好的 cDNA， 确定扩增 cDNA 的大小范围 （150 bp～1. 5 kb， 大部分为 250 bp）
15. 对两组扩增好的 cDNA， 各配制以下由放射性标记的测试 cDNA 的 PCR 反应体系 （每个反应体系 100 ul）：
77 ul H2O
10 ul 10×Taq DNA 聚合酶缓冲液
6 ul 25 mmol/L MgCl2
2 ul 10 mmol/L 4dNTP 混合物
1 ul 稀释的［32P］ dCTP
1ul 2.5 ug/ul 寡核苷酸 a2 或寡核苷酸 b2
2 ul A0 或 B0 cDNA （约 0.4 ug）
1 ul 5 U /ul Taq DNA 聚合酶
加入几滴无菌的 PCR 级的矿物油覆盖反应体系。
16. 对两组扩增好的 cDNA， 各配制 3 或4 个由生物素标记的驱动 cDNA 的 PCR 反应体系（每个反应体系100 ul）：
73.3 ul H2O
10 ul 10×Taq DNA 聚合酶缓冲液
6 ul 25 mmol/L MgCl2
6.7 ul 驱动 dNTP
1ul 2.5 ug/ul 寡核苷酸 a2 或寡核苷酸 b2
2 ul cDNA A0 或 cDNA B0 （1～５ ng）
1 ul 5 U/ul Taq DNA 聚合酶
加入几滴无菌的 PCR 级矿物油覆盖反应体系。
17. 用步骤 13 中的 PCR 扩增程序进行测试和驱动 cDNA 的合成。
18. 按厂家说明，用商业化的阴离子交换 PCR 离心柱（Qiagen）纯化扩增的 cDNA，去除未掺入的核苷酸、引物和盐。
19. 用分光光度计定量产物核酸。
20. 配制 2 个杂交反应（［32P］ An-Bio-Bn 和［32P］ Bn-Bio-An）。在一个 1.5 ml 硅烷化的微量离心管里，用乙醇沉淀 1 ug 放射性标记的测试 DNA 和 20 ug 的生物素标记的驱动 DNA，不要冷冻。风干沉淀，当沉淀刚刚干时，用吸头轻轻吹吸，重新溶于 5 ul HEPES 缓冲液。用手提式盖格计数器检测重新溶解的核酸溶液。
21. 转移重新溶解的 DNA 到一个 0.5 ml 的PCR管里。加入 5 ul 68℃ 的 2× 杂交缓冲液进行差减杂交。轻轻吹吸混匀，加入数滴无菌的 PCR 级的矿物油覆盖 DNA 溶液。最高速离心几秒。
22. 把两个管子在 95℃加热 10 min， 然后在 1 h 内慢慢冷却到 68℃，并继续在 68℃温育 2 h （快速杂交）。
23. 混合 7 ul 1 mol/L的 NaCl 和 140 ul HEPES 缓冲液，加热到 68℃。加入到杂交反应中稀释反应。混匀，最高速简单离心。冷却到室温。
24. 每管中取出 5 ul，保存（用作酚抽提前的总量计算）。
25. 每管中加入15 ul 链霉亲和素，涡旋混匀，室温温育 5 min。
26. 每管用等体积的 25：24 的苯酚/氯仿抽提。保留水相转移到新的管里。
27. 每管的水相中加入 10 ul 链霉亲和素。混匀，室温温育 5 min。
28. 用苯酚/氯仿和氯仿各抽提两次。测量每管的水相体积。
29. 每管中取出 5 ul，保存（用作酚抽提后的总量计算）。
被去除掉的测试cDNA的百分比用以下等式估算：
％ 去除的测试CDNA＝100 一（酚抽提后总量 ×100/酿抽提前总量）
30. 用 An 或 Bn 测试 cDNA 和合适的驱动 cDNA 重复差减的过程（步骤 15～29）。驱动 cDNA 的选择由差减的策略决定。用 An 或 Bn 驱动 cDNA 进行快速杂交（2 h），用 A0 或 B0 驱动 cDNA 进行长时间杂交（30～40 h）。差减的进程用隙缝斑点杂交检测。
31. 用步骤 13 的程序扩增 5 ul 差减 cDNA （An 和 Bn）。用一个商业化的阴离子交换 PCR 离心柱纯化 PCR产物（如Qiagen）。
32. 用在连接子上有剪切位点的合适限制酶（针对于这里所用的连接子，如 Ec0RI 和 EcoRV）消化 cDNA。
33. 苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀纯化消化的 cDNA。
34. 把 DNA 连接到合适的载体中（如 EcoRI 或 EcoRV 切开的 pBluescript）。
35. 转化载体到感受态细菌里。
36. 铺板培养差减文库。
值得先通过滴定文库以获得单克隆。确定含插入片段克隆的百分比和插入片段的大小也很重要。
插入片段应当是 250 bp 左右。如果插入的片段 ＞500 bp， 则可以认为是插入了两个片段。
37. 从每个起始滤膜制备 4 个重复的印迹。
38. 按照厂家说明，变性、中和和交联印迹。
39. 用差减探针杂交这些重复的滤膜。
40. 从库里随机（如果估计库里绝大多数是差异表达的基因）或按照探针的杂交结果挑取 50～100 个差异表达的克隆。准备小量的质粒 DNA。
41. 对每个质粒里的插入片段进行测序，把含有相同序列的克隆归在一起。
42. 用起始组织的 RNA 分 析 ［如 Northern 印迹、 RNase 保护分析、定量 RT-PCR 或者原位杂交确定这些克隆是否确实是差异表达的。
常见问题
1. 材料
A 和 B 类细胞的双链 cDNA （ds cDNA）
2. 试剂
ALuI 和 10×ALuI 缓冲液
RsaI
10、15 和 75 mmol/L 的 ATP
10 U/ul T4 多聚核苷酸激酶和 10×T4 多聚核苷酸激酶缓冲液
寡核苷酸引物
3 ug/ul a1： 5'-TAG TCC GAA TTC AAG CAA GAG CAC A-3’
2.5 ug/ul a2： 5'-CTC TTG CTT GAA TTC GGA CTA-3'
3 ug/ul B1： 5'-ATG CTG GAT ATC TTG GTA CTC TTC A-3'
2.5 ug/ul B2： 5'-GAG TAC CAA GAT ATC CAG CAT-3’
10 U/ul T4 DNA连接酶和 10×T4 DNA连接酶缓冲液
40％（m/V）聚乙二醇 8000（PEG 8000）
25：24（V/V）苯酚/氯仿（平衡酚配制）
氯仿
5 U/ul Taq DNA聚合酶和 10×Taq DNA 聚合酶缓冲液
25 mmol/L MgCl2
10 mmol/L 4dNTP 混合物
矿物油，PCR级，无菌
800Ci/mmol ［α-32P］ dCTP （10 Ci/ul）
驱动 dNTP 混合物
乙醇
1 mol/L 和 5 mol/L NaCl
HEPES缓冲液
2× 差减杂交缓冲液
链霉亲和素溶液
EcoRI 和 10×EcoRI 缓冲液或 EcoRV 和 10× EcoRV 缓冲液
EcoRI 切开的 pBluescript 载体
EcoRV 切开的 pBluescript 载体
转化感受态菌株
3. 耗材
放射性标记的差减探针
0.5 ml 的 PCR 管
Sephacryl S-300 离心柱（Amersham Pharmacia Biotech）
Beckman Accuspin FR离心机和吊桶转子或类似的其他离心机
热循环仪
阴离子交换PCR离心柱（Qiagen）
1.5 ml微量离心管，硅烷化
手提式盖格计数器
加热块
来源：丁香实验
