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        免疫荧光双重标记TRITC-FITC(间接法)

        相关实验:光镜下双重免疫标记实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        试剂、试剂盒

        步骤

        1. 石蜡切片(贴片前的载玻片应预涂不含有荧光色素的黏片剂),厚 5 μm,常规二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化,人 PBS(pH 7.4,0.01 mol/L)。

        2. 1% 人血清白蛋白(HSA)孵育 10 min(亦可用 10% 正常羊血清代之),不洗。

        3. 抗 ACTH 血清(McAb)1:200,孵育 30 min,37℃,湿盒。

        4. 0.05 mol/L TBS(pH 7.4,内含 1% Triton X-100,下同)洗,10 min×3。

        5. 羊抗鼠 IgG-TRITC 1:100,湿盒,室温避光反应 1 h。

        6. 0.05 mol/L TBS(pH 7.4)洗 10 min×3(第一重 ACTH-TRITC 标记染色已完成)。

        7. 切片逐级乙醇脱水,二甲苯透明,空气干燥后,置于装有多聚甲醛粉末的密闭容器内,放在 80℃ 烤箱或温箱内以甲醛蒸气固定 2~4 h,使第一重染色中二抗的不饱和抗原结合部位(Fab)失活。

        8. 切片以 TBS 洗 5 min×4。

        9. 1% HSA(或 10% 正羊血清)孵育 30 min,室温,湿盒,不洗。

        10. 抗 GH 血清(McAb)1:400,孵育 30 min,37℃,湿盒。

        11. 0.05 mol/L TBS(pH 7.4)洗 10 min×3。

        12. 羊抗鼠 IgG-FITC 1:100,湿盒,室温避光反应 1 h。

        13. 0.05 mol/L TBS(pH 7.4)洗 10 min×3(第二重 GH-FITC 标记染色完成)。

        14. 缓冲甘油封片。荧光显微镜下分别以 546 nm 及 490 nm 波长的激发光观察切片组织内 TRITC 及 FITC 所标示的 ACTH 及 GH 抗原(TRITC-ACTH 阳性细胞呈红色,FITC-GH 阳性细胞呈亮绿色)。

        15. 观察及摄影。用彩色底片对切片同一部位用 546 nm 及 490 nm 波长激发光分别作两次曝光,即可在同一张照片上显示不同颜色标示的 ACTH 与 GH 两种抗原。

        注意事项


        来源:丁香实验

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