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        改良的 EnVision-HRP/AP 双酶双底物的双重免疫染色(间接法)

        相关实验:光镜下双重免疫标记实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        1. 恒冷切片或石蜡切片,厚 4~6 μm,常规处理。


        2. 0.1%NaN3+0.3%H2O2/TBS(50 mmol/L,pH 7.8)或 0.3%H2O2/甲醇,室温 20 min(阻断内源性过氧化物酶活性)。


        3. TBS 洗 5~10 min×3。


        4. 一抗 CK20(McAb)1:100,4℃,过夜。


        5. TBS 洗 5 min×3。


        6. EnVision-HRP(羊抗鼠)试剂,室温 30 min。


        7. TBS 洗 5 min×3。


        8. 正常鼠血清 1:10,室温 15 min(封闭前重标记一抗的游离位点)。


        9. TBS 洗 5 min×3。


        10. 第二种特异性一抗 Ki-67(McAb)1:100,37℃ 孵育 120 min,TBS 洗 5 min×3。


        11. 生物素化羊抗鼠 IgG1:400,37℃ 孵育 30 min。


        12. TBS 洗 5 min×3。


        13. 链霉亲和素-AKP 1:400,37℃ 孵育 30 min。


        14. TBS 洗 5 min×3。


        15. 碱性磷酸酶底物显色:NBT/BCIP,阳性产物呈紫蓝色。


        16. 聚合物连接的辣根过氧化物酶底物显色(EnVision-HRP):3-氨基-9-乙基卡巴唑/过氧化氢(AEC/H2O2),阳性产物呈红色。


        17. 洗涤后,10% 缓冲甘油或明胶甘油封片。


        18. 光学显微镜观察。

        注意事项

        为了缩短操作流程,减少脱片率,有学者建议采用不同类别或亚型单克隆抗体混合使用,也同样可获得良好的双标染色结果。

        来源:丁香实验

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