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基本方案3 将外源基因序列插入到复制缺陷性基因组人类单纯疱疹病毒（HSV)载体

相关实验：构建复制缺陷型疱疹单纯病毒载体实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

实验材料	IE 基因补充细胞在24孔板中单层培养IE基因补充细胞系复制缺陷性 HSV 载体带外源基因的质粒
试剂、试剂盒	苯酚氯仿异戊醇核糖核酸酶灭菌水完全改良的基础培养基乙醇外源基因引物对反转录酶及其缓冲液 DTT 1-溴-3-氯丙烷 DNA 抽提缓冲液 10 X PCR 扩增缓冲液三磷酸脱氧核苷混合物三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水胎盘 RNA 酶抑制剂总 RNA 分离试剂氯仿异丙醇
仪器、耗材	外源基因序列的 DNA 探针研磨杵 96孔平板及24孔组织培养板微量离心管 Taq DNA 聚合酶组织培养皿摇床

步骤

1. 将经Pac I 酶切的复制缺陷型H S V 载体与含外源基因的线性化质粒共转染IE基因补充细胞培养。在 96孔平底组织培养板中分离出单个斑点。（基本方案2 , 第 1〜18 步)。 2. 从每个板孔中转移80W 培养基到一个新的％孔板。将新板保存于一80°C (病毒株）。 3. 在每个板孔中将剩余的2〇W 培养基（含病毒）与 IOOjuI完全培养基/10% F B S 混合。从 IE基因补充细胞的培养板孔从吸取培养基到一个24孔板，并加入120jul含病毒的培养基。孵育60〜90min，每隔15min摇晃一次培养板以保证接种物平衡分布。 4 . 吸附反应后，抽吸接种物，然后加入Iml新鲜的完全M E M /10%F B S 培养基。孵育 2〜3d。检测培养物并以细胞变圆作为细胞病变效应（C P E ) 的证据（基本方案2, 第 11步)。 5. 用微量移液器tip刮擦每个孔单细胞层，转移悬浮液至1.5m l 微量离心管。室温下以最大超速离心IOmin以沉淀细胞及病毒。 6. 小心吸取上清液，用 50(V l p H 7. 5 T B S 洗沉淀。以最大超速离心5m m 以沉淀细胞及病毒。抽吸上清液。 7. 用 200p l D N A 抽提缓冲液重悬沉淀。 37°C 摇床孵育过夜。 8. 2004 25 :24 : 1 苯酚/氯仿/异戊醇抽提溶胞产物。剧烈涡旋混合两相。 9. 室温下以最大超速离心5m i n 以分离两相。去除下层（有机）相，保留上层水相及界面。 10. 20〇4氯仿抽提水相。颠倒混合两相。室温下最大超速离心2min以分离两相。转移上层（水相）至新试管。由于D N A 极端黏稠，将呈可见的黏液吸入吸量管。 11. 力卩 500W —20°C 异丙醇沉淀病毒D N A 。室温下以最大超速离心15min。小心抽吸上清液。 12. 用 500^170%乙醇洗沉淀，颠倒。离心5min。抽吸上清液，自然晾干。 13. 50jul水重悬沉淀。使用插入外源基因序列特异性D N A 探针进行斑点印迹或Southe m blot杂交（附录3G ) 以分析病毒D N A 。 14. 取 IXlO5 IE基因补充细胞种植至30m m 组织培养皿。孵育过夜。（孵育后板子从非汇合到汇合） 15. 抽吸培养基，加人含IXlO7Pfu含外源基因重组病毒（第 2 步； M O I = IO; 见病毒滴度测定）50〇4无血清M E M 培养基。孵育 60〜90min，每隔15min摇晃一次皿以保证接种物平衡分布。 16•吸附反应后，抽吸接种物，然后加入2m l 的完全M E M /10% F B S 培养基。孵育 12〜16h〇 17. 每个皿中加入0.8ml T R I 试剂溶解细胞。刮擦皿并转移细胞溶解物至一无菌1.5ml 的微量离心管中。匀浆器使溶胞产物均匀化，并在室温下孵育5min。 18. 在溶胞产物中加入0.1ml B C P , 涡旋15s。室温孵育2〜3min。 19.室温以最大超速离心15min，转移上层（水相； R N A ) 到一个新的1.5m l 离心管。 20. 加人0.5ml—20°C 异丙醇沉淀R N A ，室温孵育lOmin。室温最大超速离心lOmin。

21- 7 0 % 乙醇洗涤R N A 。室温最大超速离心5min。抽吸上清液并自然晾干。 22-50jul水溶解抽提的R N A 。加 1000U 核糖核酸酶-胰脱氧核糖核酸酶I破坏 D N A 模板 37°C 娜育 60min。 23. 75°C 孵育 IOrnin使酶失活。准备R T -P C R 分析缓冲液（每次反应20juD: 5X Superscript II缓冲液； 2ixl I.Ommol/L D T T ； Ijul lOOng/^1外源基因，乳糖操纵子Z 或 G A D P H 阳性细胞对照； Ijul 10mmol/L 4dNTP 混合物； Ipl lOU/jul Superscript II反转录酶； 5“ R N A 样品； 5jul无菌水； 3 7°C鮮育 3Omin。 24. 准备P C R 分析缓冲液（每次反应8〇4): 10/ul IOXPCR 扩增缓冲液，含 15mmol/L M g Q 2; V l 10mmol/L 4dNTP 混合物； IjlJ lOOng/W 外源基因，乳糖操纵子Z 或 G A D P H 引物对； Ijul 10U /V 1Tag D N A 聚合酶； 64/J 无菌水。 25•加入P C R 分析缓冲液使R T -P C R 反应体积达IOOjLJ。按下列程序扩增： 30个循环 Imin 95°C (变性） Imin 60°C (退火） IOmin 71。 (：（延伸） 26•以外源目的基因，乳糖操纵子Z (阴性），或细胞因子对照GAi3D H 的特异性D N A 为探针通过Southern blot杂交分析R T -P C R 反应产物。以材料列表中的引物扩增的GARDH及 ^ c Z 片段长度分别为614bp及 324bp。如果外源基因插入到载体中，则 ZacZ片段应该不能检测到。支持方案 1 单纯疮疼病毒系的制备材料（标V 的条目参见附录 1) 适合于病毒生长的受体细胞已知滴度的病毒株（支持方案2) 公完全改良的基础培养基/10% (W V ) F B S 及无血清培养基（完全 M E M /10% F B S 及完全M E M ) lmol/L H E P E S (N -2-羟乙基哌嗪-2-乙磺酸） 25cm2 组织培养瓶 15m l 及 50m l 圆锥形聚丙烯离心管 Beckman G P R 制冷台式离心机及G H 3. 7 浮桶式离心机 Cup-horn 超声破碎器（ VirTis)

50m l 聚丙婦O a k 离心管 Beckman J2-21M 制备离心机和JA-20转子（制备） 850cm2组织培养滚瓶滚子摇瓶装置，细胞刮棒 1. 种植L O X l O 6个受体细胞于25cm 2 组织培养瓶。孵育 1〜2d (直到细胞活性分裂）。 2. 转染当天，从单层细胞抽吸培养基。加入含3XlO4Pfu 病毒（M O I = 0 . 0 1 ) 的 Iml 无血清M E M 培养基。孵育60〜90min使病毒吸附于细胞上，每隔 15min摇晃瓶子以保证接种物平衡分布。 3. 抽吸接种物，加人10m l完全M E M /10%F B S 培养基。孵育直至所有的细胞显示细胞病变效应（CPE)。例如，聚集并开始从瓶底脱落；每天检测细胞两次。 4. 通过轻叩或刮擦瓶底移去细胞。转移细胞悬液到15m l 圆锥形聚丙烯离心管中。 4°C ， 1500g■离心5min〇 5. 将上清液移至新试管中， 4°C 短时保存。用完全M E M /10% F B S 培养基重悬沉淀使终体积为lml。 6. 冷冻（一80°C ) 及溶解（37°C ) 转染细胞悬液3 次。用 Cup-horn超声破碎器高频声波分裂混悬液5s， 4°C 2000g 离心5min沉淀碎片。 7. 将上清液与保存于4°C 的上清液（第 5 步）混合，转移至50m l 聚丙烯O a k 离心管。 4°C 48 OOOg离心30min沉淀病毒。 8. 小心抽吸上清液，以完全M E M /10% F B S 培养基重悬沉淀使终体积达lml。测定病毒的滴定度（支持方案2)。 9. 将病毒制品分装至2m l 冷冻管，保存于一80°C 备用。 10.在两个850cm2 滚瓶中分别种植2. OXlO7个受体细胞。孵育1〜2d。 11. 转染当天， f顷倒瓶中的培养基。每个瓶中加入含I X IO6 pfu病毒（M O I = 0.01) 完全无血清培养基20ml。使病毒在滚瓶装置中37°C 吸附60〜90min。 12. 吸附反应后，倒出接种物，每瓶加入1〇〇〜125m l 完全 M E M /10% F B S 培养基。 37°C 孵育至所有细胞聚集并从表面分离。每天至少观察细胞两次以获取准确的收获时间。 . 13. 用细胞刮移去滚瓶表面的细胞。将混悬液移至50m l 圆锥形离心管。 4°C ， 1500g离心 5min沉淀转染细胞。 14. 将上清液移至新试管， 4 C 短时保存。兀全M E M /10% F B S 培养基重悬沉淀物使终体积达2ml。 15 . 冷冻（一80°C ) 及（37°C ) 转染细胞3 次，注意防止试管爆裂。用超声破碎器处理混悬液5s， 4°C ， 2000g 沉淀细胞碎片。 16. 将上清液与4°C 保存的上清液（第 I4 步）。转移至冰上50m l 聚丙烯〇ak Ridge试管。 4°C， 48 OOOg 离心 30min。 1 7 . 小心抽吸上清液。完全M E M /10%F B S 培养基重悬沉淀物终体积达i 〜2mi。分装 lOOjul到 2m l 试管中一80°C 保存。减少传代次数以避免缺失必需基因的病毒增殖过程中野生型病毒的增殖机率。

18. 测定病毒株的滴定度（支持方案2)。 1 9 . 任意：为了进一步纯化病毒， P B S 重悬沉淀，蔗糖、 T -1 0 葡聚糖或Nycodenz梯度纯化（如 C P M B U N I T 16.11)。储存前加入1 0 % 的甘油。蔗糖梯度纯化是用线性 3 0 % 〜 6 5 % 梯度， 4°C ， 71 OOOg 离心 16h D 支持方案 2 噬菌斑分析测定病毒滴定度本分析试验需重复2 或 3 次。材料（标V 的条目参见附录1) 适合于病毒生长的受体细胞用于滴定的病毒株 V 完全改良的基础培养基/10% (V /V ) F B S 及无血清培养基（完全M E M /10% F B S 及完全M E M ) V l % W V ) 甲基纤维素 V I % W V ) 龙胆紫溶液 12孔组织培养板 1. 将 I.O X l O 5 个受体细胞种植于1 2 孔组织培养板中。孵育过夜直至细胞形成几近汇合的单层细胞。 2. 第二天，制备含10倍稀释浓度（K T 5〜10-ltO 病毒Iml完全无血清M E M 。将双份 1(%1稀释液到受体细胞孔中。 37°C 孵育60〜9Omin使病毒吸附，每隔l5min 摇晃一次板子4 种植物平衡分布。 3. 吸附反应后，抽吸病毒接种物。加人Iml 1.0%甲基纤维素覆盖。孵育3〜5d 直到界限清晰的斑点出现。 4. 当斑点清晰可见时，抽吸甲基纤维素。用 Iml 1 % 龙胆紫室温染色5m m 。 5. 抽吸染液，用自来水轻柔冲洗板子去除过量的染色液。自然晾干。 6 . 计算每个孔的斑点数。确定每个稀释孔中斑点的平均数，乘以 10得到各个稀释孔每毫升斑点形成单位数。这个数值在乘以10到稀释倍数得到病毒株每毫升噬斑形成单位（pfu/ml) 的滴定度。支持方案 3 分离病毒 DNA 病毒D N A 的转染性是通过计算病毒D N A 转染进人受纳细胞后每微克病毒D N A 产生的斑点数的比率来衡量。纯化病毒D N A 使每毫克纯化的病毒D N A 100〜1000个斑点。材料（标V 的条目参见附录1) 单层受体细胞，培养于150cm2组织培养瓶及60m m 组织培养皿已知滴度的H S V -I 病毒株（支持方案1) V 兀全改良基本培养基/10% F B S 及天血清完全改良基本培养基（完全]yiEM/10% F B S 及完全无血清M E M )

八三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS), p H 7. 5 V D N A 抽提缓冲液 725 :24 : I (V /V7V ) 苯酚/氯仿/异戊醇氯仿异丙醇，一20°C 7 0 % 乙醇标记总H S V ~1病毒D N A % (m /V ) 甲基纤维素 % (m /V ) 龙胆紫溶液 150cm2组织培养瓶细胞刮（任选） 15m l圆锥形聚丙燦试管 Beckman G P R 制冷台式离心机及GH-3. 7 浮桶式离心机摇床（如 N utator、 BectonDickinsonPrim aryCareDiagnostics) 热封闭巴斯德吸管宽口移液管 Tip (B10-Rad) 1 . 吸取 150cm2 组织培养瓶（约 L 7 x i 0 ?个细胞）中从非汇合到汇合生长单层细胞养基。在转染前 3 d 和前 1 天细胞应该 1 : 2 传代，以确保细胞是快速增殖。细胞的选择应该根据它是需要，去互补必需的正基因缺失突变还是多基变，或者是野生型病毒。 2 . 细胞接种在5m丨无血清完全培养基， 5.0X l 07pfu 病毒（ MOI= 3 ) 转染， 37。 c 孵， 60〜9〇 m m ，每 15min摇动培养瓶一次，使接种物分散均匀。 3. 感染完^ 后，、吸去接种物，加人 2〇 m l完全培养基M E M (含 1〇% FBS)。孵育 18, 24： 1^定时检测 C P E 的形成（以细胞变圆但仍然贴壁为标准）。 4. 剧烈拍打培养瓶或者用细胞刮，收集细胞。转移细胞悬液到;iSm l 离心 4°C离心 5〜 lOmin。 ^ 5. 去除上清液， 5ml TBS ( p H 7.5)重悬。 6. 汇集两管5m l 悬液到— 个管子， 1 5 0 0 〜 2 0 0 0 g ，离心 5 〜 1 〇 m m 。 7. 加 5m l D N A 抽提缓冲液，上下颠倒数次重悬细胞， 37。〇摇床孵育过夜。重要 ^疋示：不要振荡细胞悬液，以防止破坏病毒 D n a 。 ^ 酔二氯仿：异丙醇为奶 9•室/ 血 2000g 离心 5min，弃去下层有：M 机相， : 1 的混合液，轻柔颠倒混勻，不鎌荡。保留中间层。 1H r 离H 轻柔颠倒混勾，室温 2〇 o〇 g 离心 5酿，转移尽可能多的水相到新白病毒D N A 在中间层，十分黏稠，在移取时会呈泥浆状黏在移液器上 1L 丽，混勻后職 ■ 出 ^ 的 D N A 转移沉淀物麵的旧 D N A 离心管。腦封口。撕巴斯德管 _ 斯 ‘ 缠绕，舰有 d n a D N A白那一& 保留在离心管中，过夜风干D N A ，宽口的 Tip加 lml水重悬。

12. 260nm、 280nm紫外分光光度计测量D N A 浓度（附录3D; 纯的制备物在八 26 。/28。>1.7)。 13. Southern杂交时，用几种限制性内切核酸酶酶切I jug病毒 DNA, 琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物（附录 3G)。应用附录 3G 中描述的条件进行转膜和杂交，当利用 HSV-I 病母D N A 为探针检测病毒DNA完整性时除外。 14. 取I y g 由第11步得来的病毒DNA，在 60m m 培养皿中转染受体细胞（基本方案2, 第 1〜10步，跳过质粒共转染这一步）。小心加入4m l 完全培养基M E M (含10% FBS)，孵育 24h。 15•转染后的第一天，去除培养基，加入3m l l % 的甲基纤维素溶液。孵育并定期检查特征性噬菌斑的形成。 16. —旦噬菌斑形成，吸去上层，加人 2m l l % 结晶紫染液。室温孵育5min，吸去染液，流水冲洗，风干。 17•计算每平板的噬菌斑数目，计算每个每m g D N A 所形成的噬菌颗粒的数目。好的产物为每毫克 D N A 形成 100〜1000个噬菌斑。

来源：丁香实验

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