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基本方案1 构建 HSV-1 IE基因补足型细胞系

相关实验：构建复制缺陷型疱疹单纯病毒载体实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

实验材料	Vero 细胞
试剂、试剂盒	PBS 新霉素盐溶液结晶紫染液 10 X PCR 扩增缓冲液 DNA 浓缩缓冲液 CaCl2 酶 EDTA Taq DNA 聚合酶 2 X HEPES 缓冲盐 4dNTP 混合液冻存培养基甘油
仪器、耗材	组织培养瓶冷冻离心机胶纯化质粒 DNA 片段完全 MEM 培养基组织培养皿细胞刮

步骤

1. 转染前3 天，用 1 : 10胰酶/E D T A 消化Vero细胞，培养2d。 2. 转染前一天，消化细胞1 : 2 传代到3〜5 个 60m m 培养皿中，控制细胞浓p 在 1〇6/皿，使用含10%胎牛血清的M E M 的完全培养基。培养ld。 — ^ 3•对每个皿的转染，先配制转染混合物： 2〜10吨胶纯化的质粒D N A ，用 2X 释到500^1，冰上孵育20m m 。准备转染试剂3 份。 ’ 6 怖此质粒必须包含有 H S V I E 基因启动子调控的 I C P 2 7 编码序列。疮參广主 ^ 室可能提供这质粒或者用 G e n B a n k 的 H S V I 序列克隆 H S V 文库。各药 ‘; S = $ 粒可以商业购买到（如从 Clontech, Stratagene， U S B ) 。

4•将34^l2mol/LCaCl2 逐滴加人到转染混合物中，混匀后室温孵育20min。弃培养基并用 Iml 2X HePBS 洗一遍，小心不要让细胞完全干。 5•上下颠倒混匀转染混合物以破碎大块的沉淀物。小心将转染混合物加人到培养的细胞中， 37°C孵育 lOmin。 6. 每个培养皿中加入2.5m l完全培养基，培养 6h。小心弃培养基（不要引起细胞漂浮），再用 Iml 2X H e PBS 洗一遍。 7•每个培养皿中小心加人2ml 20% 的丙三醇。室温孵育3h。 8. 小心弃掉丙三醇溶液，用 2m l 完全培养基洗3 遍。再小心加人3m l 完全培养基，培养 24h。 9. 24h 后，弃培养基，再加入 3ml完全培养基，培养 48h。 10. 48h 后，用 I.5ml 胰酶/EDTA 消化细胞，4°C ，IOOOg 离心 5min。对于新霉素抗性克隆 Ila. 用 IOml含 I m g /m l 新霉素的完全培养基重悬细胞沉淀，按 4X 105 个细胞/皿接种细胞。 12a. 孵育直至药物抗性的克隆出现，用加X !m g /m 丨新霉素的完全培养基每3c|换液。筛选过程在第二到第三个星期内开始。克隆的出现不明显，生长迅速。注意：不要从含新霉素的培养基中转移细胞对嘌呤霉素抗性的克隆 lib. 用 3m l 含 1 0 % 胎牛血清的M E M 的完全培养基重悬沉淀物。接种细胞到1〇〇mm 细胞培养皿中。孵育 2〜3d (2〜3 个分裂周期）直至细胞基本完全汇合。 12b. 用 3m l 完全培养基换液。孵育直至药物抗性的克隆出现，用加入 lmg/^ i嘌呤霉素的完全培养基每3d 换液。用加人lmg/m l 嘌呤霉素的含1〇%胎牛血清的M E M 的完全培养基每3d 换液。筛选过程从加入药物的24h 开始。很少细胞可以在药物的处理下存活，但这些存活下来的细胞会不断复制并成为克隆的中心。为减少假阳性克隆的出现，即使药物抗性的细胞生长的缓慢，也要保持 10|ug/ml的嗓呤霉素农度。在药物处理的情况下，嘌呤霉素抗性的克隆没有新霉素抗性的克隆长的好。 13. 克隆中心出现后，轻轻吸出培养基。一滴滴加入2 0 4 胰酶/EDTA到每个分离的克隆中心，以保证它们较好的分离开。 14. 用200； /1的TIP头将培养皿上的克隆刮下，再将每个刮下的细胞克隆转移到装1〇ml 含 1 0 % 胎牛血清的M E M 的 15m l 离心管中。在将其按100jLxl /孔转移到圆底的％孔组织培养板中。培养细胞以增殖克隆。 15. 扩大每个药物抗性的克隆（如 9 6 孔板中被药物抑制的细胞）到 25cm2 培养瓶中，用加有适当药物的含1 0 % 胎牛血清的M E M 的完全培养基培养。当嘌呤霉素抗性的克隆在25cm2 培养瓶中生长，将嘌呤霉素的浓度降到5〜7jug/m i 以加速克隆的生长。 16. 用含有合适药物抗性的冻存液冻存细胞。一80°C冷冻后转移到液氮<中去。 17. 从药物抗性的细胞克隆中分5X 10°个细胞到3〇 mm组织培养皿中。培养过夜

18. 弃培养基并用 P B S 洗一遍。将细胞从培养皿上刮下来再转到 L 5ml 离心管中， 25°C高速离心3min聚集细胞。 19. 弃上清，加入 200WDNA抽提缓冲液来裂解细胞。 37°C孵育 l i l 2h (到无颗粒为止）。将裂解液煮15min。 20. 制备？ 0 ^ 反应混合物（10〇4体系）： lOpl 10XPCR 扩增缓冲液（含 15mmol/L MgCl2); 知1 10mmol/L dNTP 混合物； lOOng/pl ICP27 引物对（200ng); 2pJ lOU/jul Tag DNA 聚合酶； 1〇4裂解液； 72jl J 无菌水。 21.用下面的扩增程序去扩增溶解产物 . 3 0 个循环： Imin 95°C (变性） Imin 60°C (退火） IOmin 60°C (延伸) 22•用琼脂糖凝胶电泳和用rcP 2 7 特异的 DNA探针进行 Southern斑点杂交分析PCR 反应的产物。用材料所指中特异的ICP2 7 基因的引物扩增了长为219b p 的产物。 23. 从 JCP27 阳性克隆中分I.5XlO6 个细胞接种到_ mrr^ 养皿中，加 5mi 完全培养基。 1 或 2 个皿用来进行突变检测。同时 1〜2 个皿的 Vero细胞用来作为阴性对照。培养 24h。 24. IXlO3Pfu 的 HSV ICP2 7 突变病毒稀释到 5004 无血清的 M EM 中。孵育 60〜 90min，每 15min 摇皿一次。 25. 贴壁后，弃病毒培养基，加 3ml 1 . 0 % 甲基纤维素覆盖。孵育直至斑点出现。一旦斑点出现后，弃甲基纤维素。室温用 1 % 结晶紫染液染色5min。 26. 弃染液。用自来水轻轻洗皿除去剩余的染料。空气风干。确定补充的细胞系。如果新霉素或者嘌呤霉素抗性的克隆可以补充基因产物（ICp4、 ICP27I或者 CP0)，那么斑点就会出现在培养板中。对于含有两个h S V IE 基因融合的克隆， IE 基因中一个突变体的缺失可以在补偿细胞中生长。要求正基因突变体补偿细胞系可以进行进一步分析以确定最好的补偿细胞。 27. 将 ICP2 7 阳性补充的细胞克隆中的L 5 X 106 个细胞接种到 6〇〇 mm培养皿中，加 3ml完全培养基，培养 2〜4h。 28. 5X 106 和 I Xl O7Pfu (MOI-二5 和 10) HSV I E 基因突变体稀释到 500一无血清 MEM 中。孵育 60〜9Omin来吸附细胞，每 i5min 摇皿一次。 29•弃病毒接种体加入3ml 完全培养基，培养 18〜24h。 30. 用细胞刮将细胞从培养板刮下来，转移到 i 5mi 离心管中。 31 . 准备储存液进行滴度测定（支持方案 i ，第 4〜9 步）。将测滴度的病毒液稀释为3 个浓度（支持方案 2) 计算母个细胞产生的颗粒数来确定裂解量。补偿单个正基因突变的抗性克隆

有不同的裂解量。 32.挑取病毒复制最快的克隆保存，一80°C 冷冻后转液氮。

来源：丁香实验

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