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基本方案非放射性蛋白质截短试验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

试剂、试剂盒

仪器、耗材

Perkin Elmer 2400、9600 或 9700 PCR 仪保鲜膜 PVDF Western blotting 膜塑料托盘 Whatman 3MM 滤纸 SDS-PAGE 系统化学发光底物试剂盒非放射性蛋白质截短试验试剂盒灭菌巴氏德管

步骤

1.取 1〜 3哗乙醇中保存的R N A ，加 0.1倍体积的3m ol/L乙酸钠(pH5. 6),12 OOOg 4°C 离心 lOmin。 2. 用灭菌巴氏德管吸掉上层液体，空气中干燥，注意不要太干。 3a. 随机引物扩增:在上述R N A 中加2M1 0. 随机引物和8. 5 4 水(或两者事先的混合物10. 5 4 也可），混合后，65°C 孵育 IOmin后立即置冰上。 3 b .特异性引物(GSP)扩增:在空气干燥的R N A 中加人8. 5 4 水和 24 lOpmol/^l 的反向引物，混合，在 65° C 孵育 IOmin后立即冰浴。 4•加入下列成分至总体积2〇4: 反转录酶缓冲液 0. l m o l / L D T T 2^1; 10mmol/L 4d N T P 2^1； 40U /jli1RNasin 0. 5/^1； 5〇 U /)lx1反转录酶 I.Ojml。 30°C 孵育 10min，42°C 孵育 60min。 5.可选:准备R N A 引物，加入 4U RNase H 37 Cf浮育20m i n 用于第二链扩增(产物可储存于一20°〇。 6. 准备 25W 第一轮P C R 混合液1: 10mmol/L 4 dNTPljul；第 5 步的 c D N A 2〜知I; 基因特异性正向引物20pmol;

基因特异性反向引物20pm〇 l; 加水至25卩1。 7 . 准备25jul下述混合液2: 10X P C R 缓冲液5^; Tag 酶 0.5〜2U ; 加水至25卩 1。 8. 加 25|ul混合液2 至混合液1，按下述参数进行第一轮P C R 扩增（Perkin Elmer 2400、 9600 或 9700 P C R 仪）：起始步骤 2min 94〇C 25〜30个循环 15s 93〇C 30s 55〜60°C lmin/kb 72°C 最终步骤 7min 72〇C 将 P C R 产物储存于4°C-。 9 . 准备 2 5 M 1 第二轮扩增混合液1: 10XPCR 缓冲液 T 叫酶 0.5〜2U ; 加水至2 5 4 。 10. 准备 25p J第二轮PCR混合液2: 1 0 m m o l / L 4 d N T P lj^ l；加尾内部前向引物2 0 〜 3 0 p m o l ; 内部反向引物2 0 〜 3 0 p m o l ; 1 0 X 稀释或未稀释第一轮P C R 产物 2 5 0 〜 3 0 0 n g D N A I jlJ ; 加水至25/lJ 。 1 1 . 应用第 8 步的参数进行第二轮P C R 扩增。 1 2 . 琼脂糖凝胶电泳分析P C R 产物。注意任何片段大小的异常可能意味着:遗传重排或突变影响到R N A 剪切，或 R T - P C R 过程中被基因组D N A 污染。 1 3 •将下述成分加到0. 5 m l P C R 管中： 50〜500ngPCR 产物 I jljJ ; 4X T 7 转录混合物1.25^; 水 2. 75^1。 3 0 °C 孵育 1 5 m i n 。 I4. 可选:将2. 5/al转录混合物进行1 % 琼脂糖凝胶电泳，分析其转录效率。如果在PCR 产物下有一条清晰可见的R N A 条带则意味着是成功的。 15•将2. 5M 1转录混合物(第13步)和IOmI 翻译混合物(生物素标记的赖氨酸），3(TC孵育 60min，储存于一20°C 。 16. 用水和乙醇清洁玻璃板和Spacers，在制胶格中安装两个胶盒(附录3F 的 Mini Protea n ll制胶系统）。 17. 准备下述混合液用于制备两份1〇%的胶：

30%( m /V )37. 5 : 1 丙烯酰胺/双丙烯酰胺3. 3ml(可根据产物大小调节浓度) ； I.5mol/L Tris • Cl，p H 8. 8 2. 5m l ; 水 4m l ; 10% SDS IOOjLtl; A P S lOOjul； T E M E D 4^10 加 18. 将上述混合液倒入准备好的两玻璃板之间，液面距小玻璃板上缘2. 5c m ，小心将7jC 至胶液上，使两者之间形成一平整的液面。 60m i n 后胶凝固。 19. 准备下述混合液用于制备两份堆积胶： 30%(m /V )37. 5 : 1 丙烯酰胺/双丙烯酰胺67〇4; lmol/L Tris • Cl,p H 6. 8, 500^1；水 2. 7m l ; 10% SDS 40^1; A P S 40^1； T E M E D 4^1〇 20. 将玻璃板间的水去除，小心加入堆积胶混合液，小心插入梳子，注意不要留有气泡。等待 15min，让胶凝固。 21. 移走梳子，用水冲洗加样孔，将胶板安装到电泳槽上，加上电泳缓冲液。 22. 将 2^x1翻译产物和124 SDS上样缓冲液混合，点离，P C R 仪上 95°C变性 4min。 23. 上样:包括样品、对照及Makers。 24. 70V 电泳 15〜30min。 25. 再将电压加至120V 电泳1〜I.5h 。 26. 分开玻璃板，取出胶，去掉堆积胶，将剩余胶置于冰预冷的电转缓冲液5min。 27. 用甲醇冲洗P V D F Western blotting膜 lmin，用电转缓冲液冲洗5min。 28. 将胶从缓冲液中拿出，去除多余的液体。将一 7c m X I O c m 的 W h a t m a n 滤纸盖在胶上，轻压滤纸，赶走滤纸与胶之间的气泡。 29. 将电转缓冲液至塑料托盘中，将电转盒放在塑料托盘内，用电转缓冲液浸湿纤维垫和其他相关膜或垫，按下列步骤进行安装(注意不要留有气泡）：纤维垫；两张 7c m X IOcm 的 Whatman 3M M 滤纸；胶(倒置安装）；电转膜；一张 What m a n 3M M 滤纸；纤维垫。 3〇.将电转盒关紧并插入电转固定架内。将一冰盘放在装满电转缓冲液的缸中。 31. 120V 、250m A 电转 lh。 32. 将膜取下，用 T B S 洗膜

化学焚光检测 33a. 将膜置于25ml I X 顺丁烯二酸溶液中或2 % 的封闭剂中封闭，室温下40min或 4°C 过夜。 34a. 加 5^x1POD偶联链霉亲和素至封闭液中，温和摇动室温下孵育30min。 35a•准备5m l 检测溶液，g卩 5m l 发光底物和50m r 溶液B 混合，用前室温下避光保存。 36a. 用 50m l 洗涤缓冲液洗膜4 次，每次 lOmin。 37a. 将光敏感底物溶液倒入一塑料托盘内，将膜浸入到溶液中，温和摇动lmin。 38a. 用保鲜膜将膜包起来，避免气泡。 3 % . 将膜在X 线底片上曝光或用荧光探测器检测转录产物的特征。 H A 标签的检测 33b. 将膜置于25ml T B S 溶液中或1% 的封闭剂中封闭，室温下I h 或 4°C 过夜。 34b. 将封闭液减至15ml，加 0. 2哗/1111的抗H A 抗体，温和摇动室温下孵育lh。 35b. 用 50m l洗涤缓冲液洗膜3 次，每次5min。 36b. 加 1. 3哗/ m l 抗 Ig过氧化物酶偶联抗体，室温下孵育3〇 min。 37b. 用 50n d 洗涤缓冲液洗膜3 次，每次5min。 38b. 将膜置于检测缓冲液(第37a 步)孵育lmin。 39b. 用保鲜膜将膜包起来，避免气泡。将膜在X 线底片上曝光或用荧光探测器检测转录产物的特征。支持方案 R N A 的分离与分析小心:硫氰酸胍具有刺激性，酚具有毒性，处理和使用时要小心。注意:所有的R N A 样品须在冰上操作。材料(标V 的条目参见附录1): 用 EDTA-包被的血液收集管(Greiner公司）收集的患者血标本或在75cm2组织培养皿上培养的8 0 % 〜9 0 % 汇合度的细胞 Histopague~1077(Sigma 公司） V P B S ，pH7. 8,灭菌后4°C保存放线菌酮(可选;Sigma公司）含硫氰酸胍和酚的R NAzolBCCampro Scientific公司）氯仿异丙醇 7 0 % 乙醇，4°C 100% 乙醇，4°C T 10Ea^l 冲液，pH8. 0:10mmol/L Tris • 〇/〇 •lmmol/L EDTA，pH8. 0 lmol/L NaOH SeaKem琼脂糖(FM C产品）

灭菌I X T B E 缓冲液 V 10m g /ml溴化乙键 V 3mol/L 乙酸钠(用乙酸将p H 调至5.6) V 甲酰胺上样缓冲液 R N A 大小和质量marker 12m l 白盖试管 Beckman GS-6R水平转头微离心机灭菌细胞刮片 CEP 口腔刮板(Life Technologies 公司）从患者血液中抽提RNA la. 用 E D T A -包被的血液收集管收集IOml患者血标本。 2a.各加5ml Histopague-1077至 2 个 12m l 的白盖离心管中，小心在Histopague-1077上力口5m l 血液，950g 室温下水平转子离心20min(不用刹车，让转子自然停下）。 3a.弃最上层(血清和血小板），将第二层（白色层）即淋巴细胞层转移至IOml试管中，用 4°C 灭菌P B S 洗涤，550g• 、室温下水平转子离心lOmin。 4a.小心倒掉上清，轻轻拍打试管使剩下的液体重悬白色(有时候是红色)沉淀，冰浴，接下面第5 步。从培养的细胞中抽提RNA lb. 可选:收获前，将细胞培养于含lOOjug/m l 放线菌酮的培养基中4〜8h。小心：放线菌酮有毒，须在通风橱中配制。 2b.当 75cm2组织培养皿上细胞长至8 0 % 〜9 0 % 汇合度时，倒去培养基，小心用4°C 灭菌 PBS洗涤细胞。 3b•加5ml PBS，将培养皿置于冰上，用灭菌的细胞刮板刮取细胞，将细胞转移至一新的 12m l白盖试管中，再加5ml P B S 至细胞培养皿再次刮取细胞。收集所有细胞。 4b.550g•室温下水平转子离心lOmin。小心倒掉上清，冰浴，接下面第5 步。从口腔细胞中抽提RNA lc. 要求患者用水漱口清洗口腔几次清除食物残渣(如咖啡或其他食物等)。 2c.用灭菌CEP 口腔刮板刮取口腔两侧黏膜收集细胞。 3c.将 CEP 口腔刮板置于Spin-Ease提取管中，轻微离心。将刮板及管子一起置于一新的 I.5m l 试管中，立即加1〜I.3ml R N A zoIB至刮板，孵育5min。 4c.12 OOOg离心lmin，接下面第6 步。 5. 加 I.2ml R N A z o I B 至沉淀（每 5m l 血液或 75cm2组织培养皿的细胞加1 〜I.3m l RNAzolB)。用 Tip吹打细胞几次使其裂解，将裂解液转移至一 i.5〜2.Oml的微离心管中。 6. 每 I.Oml裂解液加0. Iml氯仿，剧烈振摇15s，冰浴5min。 7.12 OOOg 4°C离心 15min〇

8. 小心转移上层清亮水相(〇. 6〜0. 7ml)至一新的微离心管中，加 1 倍体积的异丙醇，冰浴 15min(如果需要可储存于4°C 〜20°C )。 9. 12 000茗 4°C离心 15min。 10•弃上清，用 200jul 70% 乙醇洗涤R N A 沉淀。 11. 12 OOOg 4°C离心 lOmin，小心弃上清，空气干燥(不要太干）。 12. 用 50jlJ ^ 以溶解沉淀，加12〇4 100 % 乙醇后一80°C保存。 13. 小心清洗琼脂糖电泳槽，注意去除RNase的活性，用 lmol/L NaOH浸泡 lh ，再用灭菌水冲洗。 M.用灭菌IX T B E 缓冲液制备I .5 % ( m/V )SeaKem琼脂糖，其中加l 〇 mg/m l溴化乙锭至 O Jpg/m l终浓度。 15. 取相当于储存样品的5 % 〜1 0 % ，加 3mol/L 乙酸钠（ p H 5. 6)至终浓度为0 •3mol/L ， 12 OOOg 4°C离心 lOmin。 16. 小心弃上清，用 5/^1甲酰胺上样缓冲液溶解沉淀，将样品加至上样孔中，词时加R N A - marker0 17. 电泳。用手提便携式U V (紫外线）观察仪观察，对照 RNA-marker•估计R N A 的浓度、质量(如18S 和 23S rRN A条带清晰可见）和有无D N A污染(在胶的上方有大的条带)。备选方案使用偶联转录/翻译法进行放射蛋白质截短实验在体外，一个管中进行的偶联转录/翻译实验相对于非偶联方法来说要显得简单些 (但控制更加困难）。使用该方法，作者成功地翻译出160kDa的蛋白质产物(来源于一 4k b 的序列），但是，该方法翻译出的副产物(背景产物)也相应显著地增加了。材料(标V 的条目参见附录 1): TnT T7-家兔网织红细胞体外转录/翻译偶联系统(Promega公司）： TnT 17 R N A 聚合酶 T n T 家兔网织红细胞裂解物 T n T 反应缓冲液 L-亮氨酸、L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸盐酸盐的混合物含萤光素酶报告基因的质粒萤光素酶萤光素酶分析试剂 5mCi/ml[3H ] 标记的凭氣酸(]_60Ci/mmol; Amersham 公司） I.5U/^tl RNase 抑制剂（如 RNasin ;Promega 公司）灭菌水 " 2 X SD S样品缓冲液分子 marker:14C 标记(Amersham公司）的或预染的(Bio-Rad公司）蛋白质marker "染色液二甲基亚砜（ dimethylsulfoxide， D M S O )

0 1 ^ 0 ^ 50(1111〇1/乙2,5-二苯嗯唑溶解于〇“ 5 0 中，可反复使用 2或 3次），或其他放射自显影增强试剂(如Arnersham公司的Amplify、M E N Life Science公司的 E N 3H A N C E ) 塑料盒 Whatman 3M M 滤纸干胶仪 X-Omat AR 胶片（Eastman Kodak 公司） 1. 准备c D N A (从患者R N A 反转录后经过两轮扩增的P C R 产物）或扩增的D N A 样品 (基本方案，第 1〜12步)。 _2._将 T n T T 7-家兔网织红细胞体外转录/翻译偶联系统从一70°C冰箱中取出，放置于冰上，将 T n T T 7 R N A 聚合酶直接置于冰上，等融解后将所有其他成分都置于冰上。用手握法快速融解转录/翻译偶联系统。不要将TnT T 7 R N A 聚合酶放在冰上太长时间，反应系统准备好后尽可能快地将系统再次冻存。 3. 在一 L 5m l 的微离心管准备转录/翻译系统，同时用试剂盒的中荧光素酶质粒准备一个对照：家兔网织红细胞体外转录/翻译偶联系统12. 5“ ； T n T 反应缓冲液IjuJ; T n T T 7 R N A 聚合酶〇. 氨基酸混合物0. 54; 5mCi/ml[3H ]标记的亮氨酸2^ x1; 40U //m1RNasin 0. 5jul； PCR 产物 50〜500ng; 加灭菌水至25/jJ。混合后在30°C 孵育60min(在25〜37°C 不会太影响翻译效率）。在一个12pl反应体系中将P C R 产物与T n T 混合系统的比例控制在1 : 2 以下同样可以得到好的结果。 4. 在转录/翻译产物中加1 倍体积的2X S D S 样品缓冲液混合，储存于一70°C 。 5. 准备SDS^P A G E 胶，用根据翻译产物的大小选择适当的蛋白质marker，对反应产物进行电泳(基本方案，第 16〜27步）。 6. 电泳完后将胶转移至一塑料盒内，覆盖染色液，温和摇动孵育15〜30m in 。如果使用14C 标记的蛋白质marker，染色步驟可以省略。 7. 弃染色液，用脱色液反复冲洗胶块，直到蛋白质marker清晰可见。 8. 用水冲洗胶块15min。 9. 用 D M S O 覆盖胶块温和摇动IOmin,使胶块脱水。重复脱水一次。小心：D M S O 具有化学危险性，第 8〜10步中须在通风橱中进行。 10. 将胶置于D M S O /P P O 中孵育lOmin，共 2 次。 11. 用水冲洗胶块10〜15min直到胶变白。 12. 将胶放在Whatman 3M M 滤纸上，在干胶仪上干燥(60〜7(TC I h 以上）

13.用 X-Omat A R 胶片进行放射自显影(见CPM B附录 3A )，在放射自显影图上检测翻译产物的特征，如果使用萤光素酶对照，则可在图上寻找62k D a 的蛋白质条带。通常情况下，在一个12jul反应体系中翻译50ng I.5k b 的 P C R 产物经过过夜(8h 以上)曝光后很容易在放射自显影图上检测到。

来源：丁香实验

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