最新修订时间：2024-05-13
材料与仪器
步骤
来源：丁香实验
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![8. 小心转移上层清亮水相(〇. 6〜0. 7ml)至一新的微离心管中，加 1 倍体积的异丙醇，冰 浴 15min(如果需要可储存于4°C 〜20°C )。 9. 12 000茗 4°C离心 15min。 10•弃上清，用 200jul 70% 乙醇洗涤R N A 沉淀。 11. 12 OOOg 4°C离 心 lOmin，小心弃上清，空气干燥(不要太干） 。 12. 用 50jlJ ^ 以 溶 解 沉 淀 ，加12〇4 100 % 乙醇后一80°C保存。 13. 小心清洗琼脂糖电泳槽，注意去除RNase的活性，用 lmol/L NaOH浸 泡 lh ，再用灭 菌水冲洗。 M.用灭菌IX T B E 缓冲液制备I .5 % ( m/V )SeaKem琼脂糖，其 中加l 〇 mg/m l溴化乙锭 至 O Jpg/m l终浓度。 15. 取相当于储存样品的5 % 〜1 0 % ，加 3mol/L 乙酸钠（ p H 5. 6)至终浓度为0 •3mol/L ， 12 OOOg 4°C离心 lOmin。 16. 小心弃上清，用 5/^1甲酰胺上样缓冲液溶解沉淀，将样品加至上样孔中，词时加R N A - marker0 17. 电泳。用手提便携式U V (紫外线） 观察仪观察，对 照 RNA-marker•估计R N A 的浓 度、质量(如18S 和 23S rRN A条带清晰可见） 和有无D N A污染(在胶的上方有大的 条带)。 备选方案使用偶联转录/翻译法进行放射蛋白质截短实验 在体外，一个管中进行的偶联转录/翻译实验相对于非偶联方法来说要显得简单些 (但控制更加困难） 。使用该方法，作者成功地翻译出160kDa的蛋白质产物(来源于一 4k b 的序列） ，但是，该方法翻译出的副产物(背景产物)也相应显著地增加了。 材料(标V 的 条 目 参 见 附 录 1): TnT T7-家兔网织红细胞体外转录/翻译偶联系统(Promega公司） ： TnT 17 R N A 聚合酶 T n T 家兔网织红细胞裂解物 T n T 反应缓冲液 L-亮氨酸、L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸盐酸盐的混合物 含萤光素酶报告基因的质粒 萤光素酶 萤光素酶分析试剂 5mCi/ml[3H ] 标记的凭氣酸(]_60Ci/mmol; Amersham 公 司 ） I.5U/^tl RNase 抑制剂（ 如 RNasin ;Promega 公司） 灭菌水 " 2 X SD S样品缓冲液 分 子 marker:14C 标记(Amersham公司） 的或预染的(Bio-Rad公司） 蛋白质marker "染 色 液 二甲基亚砜（ dimethylsulfoxide， D M S O )](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/A1470123756707uuv4brgsqapng_small.jpg)
![0 1 ^ 0 ^ 50(1111〇1/乙2,5-二苯嗯唑溶解于〇“ 5 0 中 ，可反复使用 2或 3次 ） ，或其 他放射自显影增强试剂(如Arnersham公司的Amplify、M E N Life Science公司 的 E N 3H A N C E ) 塑料盒 Whatman 3M M 滤纸 干胶仪 X-Omat AR 胶片（Eastman Kodak 公司） 1. 准备c D N A (从患者R N A 反转录后经过两轮扩增的P C R 产物） 或扩增的D N A 样品 (基本方案，第 1〜12步)。 _2._将 T n T T 7-家兔网织红细胞体外转录/翻译偶联系统从一70°C冰箱中取出，放置于冰 上 ，将 T n T T 7 R N A 聚合酶直接置于冰上，等融解后将所有其他成分都置于冰上。用 手握法快速融解转录/翻译偶联系统。 不要将TnT T 7 R N A 聚合酶放在冰上太长时间，反应系统准备好后尽可能快地将 系统再次冻存。 3. 在一 L 5m l 的微离心管准备转录/翻译系统，同时用试剂盒的中荧光素酶质粒准备一 个对照： 家兔网织红细胞体外转录/翻译偶联系统12. 5“ ； T n T 反应缓冲液IjuJ; T n T T 7 R N A 聚合酶 〇. 氨基酸混合物0. 54; 5mCi/ml[3H ]标记的亮氨酸2^ x1; 40U //m1RNasin 0. 5jul； PCR 产物 50〜500ng; 加灭菌水至25/jJ。 混合后在30°C 孵育60min(在25〜37°C 不会太影响翻译效率） 。 在一个12pl反应体系中将P C R 产物与T n T 混合系统的比例控制在1 : 2 以下同 样可以得到好的结果。 4. 在转录/翻译产物中加1 倍体积的2X S D S 样品缓冲液混合，储存于一70°C 。 5. 准备SDS^P A G E 胶，用根据翻译产物的大小选择适当的蛋白质marker，对反应产物进 行电泳(基本方案，第 16〜27步） 。 6. 电泳完后将胶转移至一塑料盒内，覆盖染色液，温和摇动孵育15〜30m in 。 如果使用14C 标记的蛋白质marker，染色步驟可以省略。 7. 弃染色液，用脱色液反复冲洗胶块，直到蛋白质marker清晰可见。 8. 用水冲洗胶块15min。 9. 用 D M S O 覆盖胶块温和摇动IOmin,使胶块脱水。重复脱水一次。 小心：D M S O 具有化学危险性，第 8〜10步中须在通风橱中进行。 10. 将胶置于D M S O /P P O 中孵育lOmin，共 2 次。 11. 用水冲洗胶块10〜15min直到胶变白。 12. 将胶放在Whatman 3M M 滤纸上，在干胶仪上干燥(60〜7(TC I h 以上）](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/B1470123769843swuqjec2ibpng_small.jpg)
